电离辐射是由能直接产生电离的粒子或间接产生电离的粒子(或二者的混合粒子所组成。电离辐射对生物体造成损伤可以通过辐射能量直接作用于生物分子,导致DNA,蛋白质等损伤,导致细胞凋亡,造成机体组织器官功能衰竭,如造血组织功能减退,外周血白细胞数下降,消化、心血管系统功能降低,免疫系统紊乱等;电离辐射还可以通过间接作用,即通过水在辐射反应中产生的自由基、活性氧(ROS)攻击核酸、蛋白质、生物膜等重要大分子并造成转录因子活化,也导致细胞凋亡,基因突变,继发性肿瘤的发生,如白血病,放射性皮肤癌等。辐射可分为电离辐射包括带电粒子(α粒子、β粒子、质子等)和不带电粒子(X射线、γ射线、中子等);和非电离辐射包括光(可见光,红外线,紫外线)和电磁辐射(微波、射频等)。基于辐射对机体危害极大,研究放射损伤防治手段,寻找积极有效的防治药物具有重要意义。目前研究辐射防护剂机制包括两个方面,其一促进DNA修复,抑制细胞凋亡如生长因子,蛋白酶抑制剂等,但其毒副作用大,降低了临床价值;其二是抗氧化应激,降低ROS的生成如含硫化合物,酚类等,但作用浓度高,疗效低。因此,寻找一种无毒或低毒、高效的辐射防护剂显得尤为重要。天然化合物香兰素(3-甲氧基-4-羟基-苯甲醛)又名香草醛、香荚兰醛,因其具有抗氧化和抗诱变的活性广泛应用于食品添加剂中。有研究报道香兰素能清除X射线和紫外线诱导的ROS,降低染色体畸变和细胞微核率,增强DNA修复,但其作用浓度高,活性低。为此本课题组筛选出辐射防护作用更好的香兰素衍生物丁香醛(Syringaldehyde,VND3207),前期试验已经证实VND3207比香兰素更能有效的清楚自由基,降低辐射诱导的DNA损伤;同时,VND3207对γ射线致人正常细胞基因组损伤和细胞凋亡的有良好的保护作用,在实验动物水平上,VND3207能增加γ射线辐射后白细胞数,减少辐射后脾细胞凋亡率及微核形成率。基于以上的理论和实验,本课题选用α粒子致辐射损伤的细胞模型,进一步研究VND3207的抗辐射效应,并从细胞,分子水平探讨其作用机制。(1)我们通过免疫荧光实验建立了α粒子损伤的细胞模型,结果提示与γ射线相比,α粒子诱导的γ-H2AX簇集点为斑块状,损伤面积大,荧光强度强,持续时间长,ImageJ图像统计分析也得出相应的结论;同时,免疫荧光结果显示α粒子辐射后细胞内p-Chk-2与γ-H2AX呈共同的亚细胞定位。提示p-Chk-2参与了α粒子辐射后DNA损伤修复反应。(2)我们通过MTT实验检测了香兰素衍生物VND3207对正常细胞的影响。结果表明经0-100μmol/L VND3207处理的细胞,增值能力无明显变化,同时与DMSO对照组相比,细胞的增殖无明显变化,提示VND3207在0-100μmol/L对正常细胞无明显毒性。(3)我们通过细胞克隆形成实验表明无论是照射前还是照射后给与一定浓度的VND3207药物,均能增强细胞对α粒子的辐射损伤抗性。同时,在不同剂量照射下,50μmol/L的VND3207均可以提高细胞的辐射敏感抗性,照射前用药效果比照射后用药更好,反映出本课题以前报道的VND3207清除自由基的作用,由此减轻了辐射对DNA的间接损伤效应。此外AnnexinⅤ标记结合流式细胞术检测显示50μmol/LVND3207对受照细胞凋亡的发生有较好的防护作用(4)DNA双链断裂是电离辐射致细胞最严重的损伤形式。中性单细胞凝胶电泳结果表明,VND3207能明显减轻2.0Gyα粒子诱导的DNA双链的断裂率,并呈药物依赖关系;同时50μmol/L的VND3207能有效降低2.0Gyα粒子辐射后不同时间点的DNA原位损伤。微核试验表明,20μmol/L以上浓度VND3207保护下辐射细胞的微核率显著下降;免疫荧光及Western印迹实验也是显示VND3207有效地降低了0.5Gyα粒子致细胞核内γ-H2AX的表达。(5)当DNA发生断裂损伤时,机体就会启动DNA的修复机制。Western blot检测了α粒子辐射后细胞内修复蛋白的表达,结果显示5-100μmol/L的VND3207能有效的提高α粒子辐射后p-DNA-PKcs(S2056)的表达,但是对p-Chk-2的表达无明显变化。同时,免疫荧光结果表明50μmol/LVND3207可以增加α粒子辐射后NF-κB的核易位,从而抵抗辐射诱导的细胞凋亡。综上所述,VND3207对正常细胞无明显毒性,并能够有效增强α粒子辐射后细胞的辐射敏感抗性,提高细胞抗凋亡能力,保护辐射诱导DNA损伤,维护细胞基因组稳定性,增加修复蛋白的表达。因此,VND3207有开发成为抗辐射新药的价值,并成为临床治疗放射性疾病提供理论依据。