背景高血压病时存在着氧化和抗氧化系统调节的紊乱,导致活性氧(reactive oxygen species, ROS)增多。ROS可通过多种途径介导组织细胞损伤。血管过氧化物酶(vascular peroxide, VPO)是新近发现的过氧化物酶家族成员。VPO家族包括VPO1和VPO2,均能在心血管系统表达,但在血管壁中的表达以VPO1为主。VPO1具有很强的氧化特性,能催化过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)产生次氯酸(hypochlorous acid, HOCL)等多种化学物质,导致细胞损伤。由于其性质及存在位置的特异性,我们推测VPO1可能对心血管系统结构及功能起调节作用。目前对VPO1的研究处于起步阶段,尚没有检测其水平的稳定方法。原核表达系统中,常选用大肠杆菌作为表达宿主,其特点是遗传背景清楚,转化和表达效率高,并且易于操作,具有生产周期短、成本低、可以快速大量生产重组蛋白的优点。本研究用原核表达系统来制备VPO1重组蛋白,然后以其为抗原建立检测VPO1的间接酶联免疫吸附法(ELISA),并初步测定了临床高血压患者VPO1水平,从而为VPO1与高血压病相关性的研究奠定了基础。方法异丙基硫代-b-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合表达载体pQE30-VPO的大肠杆菌E.coliM15;SDS-PAGE分析重组蛋白表达量,用Ni-NTA亲和柱纯化VPO1融合蛋白,用逐步透析法对纯化后的目的蛋白进行复性。以纯化的目的蛋白为抗原,采用间接ELISA法建立稳定VPO1检测方法。收集健康体检者36例、临床高血压病患者84例,留血浆样本测定VPO1的浓度,并初步分析VPO1与高血压的相关性。结果通过1 mmol/L IPTG诱导,发现在37℃诱导4h,目的蛋白表达含量占菌体总蛋白的5%,经过SDS-PAGE凝胶电泳分析,在相对分子质量170 KDa处(全长蛋白)和70 KDa处(C端蛋白)有一条特异性的目的带,经纯化后VPO1 C端融合蛋白的纯度可达90%以上,产量为5mg/L,透析复性后可溶性蛋白达到50%以上高血压患者血清VPO1浓度为352.1±98.2ng/ml,显著高于健康对照组(155.3±94.5 ng/ml, P< 0.01)。血清VPO1浓度的分布范围为10.36 ng/ml到577.5 ng/ml,总人群中,女性血清VPO1浓度(291.5±86.6 ng/ml)与男性(305.8±92.1 ng/ml)没有差异(P=0.64)。结论VPO1水平与原发性高血压病密切相关。背景高血压及其并发症的发生发展与血管重构(vascular remodeling)密切相关。高血压过程中血管重构的类型、特点以及发生机制已成为高血压研究领域的热点之一。高血压血管重构的机制尚未完全明了,研究表明ROS诱导的氧化应激参与了高血压血管重构的各个环节。ROS是化学性质活泼、含有氧功能基团的化合物,由机体促氧化系统生成,包括超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(OH)、氢过氧化物(HOO)和次氯酸(HOCL)等。ROS的生成受多种酶类催化,其中过氧化物酶(peroxidase)家族的作用日益受到重视。我们第一部分的研究证实在临床高血压患者血浆中,VPO1水平明显升高。由于VPO1具有很强的氧化特性,能催化H2O2产生HOCL等多种化学物质,推测其可能介导氧化应激参与高血压病理状态下的血管重构。本研究联合高血压临床患者及自发性高血压大鼠,探讨VPO1与高血压病理状态下血管重构的相关性。方法选择符合入选标准的原发性高血压患者84名,颈动脉彩超检测颈总动脉内-中膜厚度(intima-media thickness, IMT),根据有无颈动脉IMT增厚分为两组,其中高血压无颈动脉IMT增厚组(EH1组)41名,高血压合并颈动脉IMT增厚组(EH2组)43名。同期选择健康体检志愿者36名作为正常对照组。检测颈总动脉IMT、弹性指数(pressure-strain elastic modulus, Ep)和僵硬指数(stiffness index,SI)。同时收集高血压患者血浆检测VPO1、H2O2水平及过氧化氢酶(catalase, CAT)活力。选取12周龄雄性自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)10只,以性别、周龄匹配的WKY (Wistar Kyoto rats)大鼠10只为对照,喂养20周后终止实验。开始及每周测鼠尾收缩压。实验结束后,麻醉后取主动脉及肠系膜三级动脉,行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining, HE)及Masson染色,利用计算机辅助成像系统测算动脉中层厚度(Media thickness, MT),管腔直径(lumen diameter, LD),厚度／腔径比(MT/LD),动脉中膜细胞平均核面积,免疫组织化学染色检测VPO1抗原在动脉壁的表达。提取胸主动脉RNA及蛋白,检测动脉壁VPO1mRNA及蛋白表达。结果(1)颈动脉超声示,高血压患者颈动脉IMT增厚明显；合并颈动脉IMT增厚患者与IMT正常的患者相比,颈动脉Ep、SI升高。(2)与健康对照组比较,高血压组患者血浆VPO1水平、H2O2水平升高而CAT活力下降；高血压患者颈动脉IMT厚度与VPO1水平、H2O2水平成正相关,与CAT活力成负相关。(3)SHR血压及血浆ANGII水平明显高于WKY组。(4)组织学切片染色显示,SHR主动脉及肠系膜动脉重构明显,动脉MT、LD、MT/LD及中膜VSMC平均核面积较WKY大鼠显著增大。(5)SHR主动脉及肠系膜动脉VPO1染色明显高于WKY大鼠。(6)SHR主动脉VPO1 mRNA及蛋白表达明显高于WKY大鼠。结论VPO1介导了高血压病理状态下的血管重构。背景我们前期研究发现VPO1与高血压血管重构密切相关,然而VPO1调节氧化应激诱导血管重构机制目前并不清楚。在高血压病理状态下,NADPH氧化酶(Nox)来源的ROS通过多种信号途径介导血管平滑肌细胞(vascular smooth musle cell, VSMC)的增殖、迁移等是血管重构重要的发病机制。细胞外信号调节激酶1／2(extracellular signalregulated protein kinase1/2, ERK1/2)是其中较重要的途径。新近研究显示,ROS家族成员HOCL除直接的氧化损伤作用外,还可激活ERK1／2信号通路诱导细胞增殖。而VPO1具有很强的催化H2O2产生HOCL能力。因此,本研究拟在人血管平滑肌细胞株,结合工具药和基因沉默技术,通过检测细胞增殖指标、VPO1表达、H2O2及HOCL水平,确证VPO1介导氧化应激促血管重构作用并初步阐明相关机制。方法培养人血管平滑肌细胞株,分别用血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, ANGⅡ)及H2O2处理,检测平滑肌细胞的增殖指标,检测细胞VPO1表达、培养液中H2O2、HOCL含量；利用Nox特异性抑制剂(apocynin)、H2O2水解酶(catalase, CAT)、ERK1/2特异性抑制剂(PD98059)初步确定Nox／H2O2/VPO1/HOC1/ERK1/2信号途径。在此基础上,观察VPO1干扰对ANGⅡ所致细胞增殖的影响。结果(1)外源性应用ANGⅡ(100nM)处理24h可显著诱导血管平滑肌细胞增殖。预先给予apocynin、CAT、PD98059能抑制ANGⅡ该效应。(2)外源性应用ANGⅡ(100nM)处理24h可显著升高细胞培养液中H2O2水平,细胞VPO1 mRNA及蛋白的表达及培养液中HOC1含量。预先给予CAT能降低上述指标水平。(3)利用脂质体2000转染方法成功建立VPO1表达沉默的人血管平滑肌细胞株,其VPO1基因表达明显下调。(4) VPO1 shRNA干扰显著抑制ANGⅡ诱导的细胞增殖效应及降低细胞培养液中升高的HOCL水平。(5)外源性应用H2O2(2 mM)处理24h可显著上调细胞VPO1表达,升高细胞培养液中升高的HOCL水平；VPO1 shRNA干扰显著降低细胞培养液中升高的HOCL水平。结论VPO1通过介导Nox/H2O2/VPO1/HOC1/ERK1/2氧化应激信号通路诱导平滑肌细胞增殖。