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滋养细胞具有高增殖和侵袭潜能;但在正常妊娠,滋养细胞不发生过度增殖和远处转移,提示可能受到细胞直接或间接作用的分子调控,使滋养细胞侵袭能力维持在生理性动态平衡。母-胎界面微环境细胞与分子间的相互作用可以调节滋养细胞侵入子宫内膜及蜕膜。因此,母-胎界面滋养细胞侵袭能力的调控分子可以影响胚泡的正常植入和生长。23号非转移性基因H1型(nm23-H1)是经典的肿瘤细胞侵袭抑制基因。在滋养细胞相关疾病中,nm23-H1的表达与预后密切相关,可以作为评价滋养细胞疾病进展的参考指标。根据相关文献报道,我们推测nm23-H1可能对滋养细胞的生理性侵袭发挥重要的调节作用,因此探寻nm23-H1表达调控将有助于阐明生理状态下胚泡植入和病理性滋养细胞疾病的分子机制。本研究在前期研究工作基础上,进一步关注nm23-H1在人早孕期滋养细胞表达的调节机制,拟阐明nm23-H1在母-胎界面促进滋养细胞和蜕膜基质细胞间交叉对话,及对滋养细胞侵袭行为的控制机制。1、nm23-H1在人早孕期母-胎界面的表达目的比较nm23-H1在正常和自然流产患者母-胎界面的表达。方法收集早孕期正常或不明原因自然流产的绒毛与蜕膜组织,采用RT-PCR、免疫组织化学、传统免疫印迹法,分析母-胎界面nm23-H1表达特征,以比较nm23-H1在正常早孕与自然流产组之间的表达差异。结果原代培养的滋养细胞中低度表达nm23-H1;蜕膜基质细胞中高度表达nm23-H1。从mRNA和蛋白水平分析绒毛与蜕膜组织的nm23-H1表达水平发现,自然流产患者绒毛及蜕膜nm23-H1表达水平明显高于正常早孕期(P<0.05)。结论人早孕期母-胎界面过表达nm23-H1将导致妊娠失败。2、人母-胎界面nm23-H1的表达调控目的nm23-H1人在母-胎界面的表达调控。方法收集早孕期正常绒毛与蜕膜组织,对原代培养的滋养细胞进行多种干预,包括妊娠相关激素、炎性介质及CsA处理,用In cell western检测滋养细胞和蜕膜基质细胞nm23-H1的表达。结果本研究发现,单独使用孕酮对滋养细胞无明显调节作用;而17β-E2或生理浓度范围β-hCG均可明显下调滋养细胞nm23-H1表达; LPS不能引起滋养细胞nm23-H1的表达下调;CsA可降调节滋养细胞nm23-H1的蛋白表达。单独使用孕酮、17β-E2或生理浓度范围β-hCG,对蜕膜基质细胞nm23-H1的表达无明显影响;而给予高浓度β-hCG处理时,nm23-H1表达较未处理组显著下降;低剂量的LPS可以显著下调蜕膜基质细胞nm23-H1的表达,但此作用并非由炎性介质IL-1β介导;CsA对蜕膜基质细胞nm23-H1无明显调控作用。结论17β-E2、β-hCG下调滋养细胞nm23-H1蛋白水平,提示nm23-H1与正常妊娠有关。CsA也可以下调滋养细胞nm23-H1,提示CsA治疗反复自然流产的新疗效机制。高浓度β-hCG可降调节蜕膜基质细胞nm23-H1的表达,提示在滋养细胞疾病状态下滋养细胞通过分泌高水平β-hCG抑制蜕膜基质细胞nm23-H1的表达,可能发生远处转移与侵袭。3、nm23-H1参与调控人早孕期滋养细胞的侵袭能力目的nm23-H1在人早孕母-胎界面的调节作用。方法采用胰酶消化、密度梯度离心法成功分离、培养人早孕期滋养细胞和蜕膜基质细胞,建立直接或间接细胞共培养;使用siRNA干扰技术,成功干扰滋养细胞或蜕膜基质细胞nm23-H1的表达,用Transwell法分析干扰nm23-H1后,滋养细胞与蜕膜基质细胞细胞共培养体系中滋养细胞的侵袭力;用In cell western法分析侵袭相关分子的蛋白表达。结果干扰滋养细胞nm23-H1后,滋养细胞的侵袭力明显增强,与侵袭相关的titin表达水平明显上调;而MMP和TIMP表达则无明显改变。干扰蜕膜基质细胞nm23-H1后,蜕膜基质细胞titin及TIMP表达上调;而MMP活性无显著差异。将干扰nm23-H1的蜕膜基质细胞与滋养细胞共培养,滋养细胞的侵袭力亦明显增强(P<0.05)。结论滋养细胞表达的nm23-H1可通过抑制titin表达而控制人早孕期滋养细胞的侵袭力。蜕膜基质细胞表达较高水平的nm23-H1,可限制滋养细胞的过度侵袭。4、nm23-H1通过MAPK/ERK1/2信号通路调节人早孕期滋养细胞侵袭能力目的nm23-H1在人母-胎界面调控滋养细胞侵袭的信号通路。方法应用siRNA干扰nm23-H1,然后分析干扰后与侵袭相关的关键信号通路激活状态。经过筛选发现,MAPK/ERK1/2通路可能是其主要通路。为了验证nm23-H1调控滋养细胞侵袭能力是否涉及MAPK/ERK1/2信号通路,将干扰nm23-H1的滋养细胞和蜕膜基质细胞,分别加入信号通路阻断剂U0126,进行以下分组:si-negative、si-nm23-H1、si-negative+U0126和si-nm23-H1+U0126,用Transwell法研究滋养细胞的侵袭力,以解析MAPK/ERK1/2信号通路介导nm23-H1控制人早孕期滋养细胞侵袭的可能机制;继而用In cell western法分析各组与侵袭相关功能分子的蛋白表达水平。结果经干扰nm23-H1后,滋养细胞系和蜕膜基质细胞内P/T-Erk水平明显升高,并可被U0126完全抑制。通过DSC与滋养细胞共培养(VCT/DSC)发现,无论干扰滋养细胞系,还是干扰蜕膜基质细胞nm23-H1,滋养细胞侵袭能力均明显升高;而U0126仅能部分阻断增高的侵袭性。提示nm23-H1通过抑制MAPK/ERK1/2信号通路降调节人早孕期滋养细胞侵袭。U0126能有效消除因干扰nm23-H1对titin的升调节作用。相关性回归分析结果显示,titin表达水平与滋养细胞侵袭性呈正相关。因此,nm23-H1可以通过抑制MAKP/RK1/2信号通路,降调节人早孕期滋养细胞或者蜕膜基质细胞表达titin,并进一步控制滋养细胞的侵袭性。结论nm23-H1通过抑制MAPK/ERK1/2通路,降调节滋养细胞和蜕膜基质细胞titin的表达,继而抑制滋养细胞侵袭力。