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Toll样受体(TLRs)是最早发现的哺乳动物天然免疫模式识别受体(PRRs)家族,也是研究最广泛的模式识别受体,其研究极大地丰富了免疫生物学内涵。TLRs和其它PRRs识别病原相关分子模式(PAMPs),可以激活细胞信号通路,产生各种炎症细胞因子,趋化因子和Ⅰ型干扰素(IFNs),从而迅速触发一系列抗微生物免疫反应。本文主要研究鸡TLR5(chTLR5)及其信号通路接头蛋白MyD88(chMyD88)的信号功能和抗感染作用,试图为家禽TLR5深入研究提供新的科学线索。本研究主要包括以下几个方面:1鸡源TLR5和MyD88基因克隆表达及信号功能鉴定分别从鸡的HD11和DF1细胞中RT-PCR扩增出chTLR5受体和chMyD88接头蛋白编码基因序列,chTLR5为2605bp,chMyD88为919bp。PCR产物分别连接到中间载体pENTR4-MCS-3FLAG,重组中间载体和目的载体pDEST47进行LR位点特异重组成功构建真核表达质粒 pcDNA-chTLR5-3FLAG 和 pcDNA-chMyD88-3FLAG。Western bloting 检测 chTLR5和chMyD88在转染HEK293T细胞中蛋白呈现高表达,大小分别约为120kD和35kD。NF-κB启动子双萤光素酶报告基因和qRT-PCR试验结果表明,chTLR5表达具有微弱的组成性NF-κB活性,能够激活低水平的炎症因子IL-1β和IL-8基因表达;细菌鞭毛蛋白刺激能进一步增强chTLR5下游NF-κB活化和炎症因子基因表达。chMyD88表达具有很强的组成性活性,激活下游NF-κB活化,诱导炎症因子TNF-α和IL-8基因显著表达。以上结果表明,chTLR5和chMyD88都具备信号活性。2荧光定量RT-PCR方法检测chTLR5和chMyD88 mRNA组织分布根据测序获得的鸡TLR5和MyD88序列,分别设计定量PCR引物,建立检测chTLR5和chMyD88荧光定量RT-PCR方法,并对健康雏鸡不同组织中TLR5和MyD88 mRNA表达水平进行定量分析。结果表明定量RT-PCR具有很好的敏感性和特异性,chTLR5 mRNA在各组织中广泛表达,胰腺和盲肠中表达量最高;chMyD88同样在各组织中表达量较高,在胰腺和肝脏中表达量最高。chTLR5和chMyD88在免疫器官脾脏中都有较高水平表达。3 外源性chTLR5和chMyD88的抗感染作用将中间重组载体 pENTR4-chTLR5-3FLAG 和 pENTR4-chMyD88-3FLAG 分别通过 LR 位点特异重组连接到目的表达载体plenti-CMV DEST puro获得重组病毒表达载体。将经过验证的重组表达载体 plenti-CMV-TLR5-3FLAG、plenti-CMV-MyD88-3FLAG 以及空载体 plenti-CMV分别转染到鸡HD11巨噬细胞,随后分别用鼠伤寒沙门氏菌(S.T)、水疱性口炎病毒(VSV-GFP)、鸡新城疫病毒(NDV-RFP)感染细胞。定量RT-PCR结果显示,与对照空载体转染HD11细胞相比,chTLR5和chMyD88转染细胞中鼠伤寒沙门氏菌增殖水平显著下降,而相关细胞因子基因表达水平上升。chTLR5和chMyD88转染HD11细胞上VSV和NDV的复制水平均降低。荧光显微镜观察病毒荧光信号强度与以上结果相一致。此外chTLR5和chMyD88转染细胞在病毒感染后下游抗病毒因子和炎症因子相关基因表达水平相应升高。4内源性chTLR5和chMyD88的抗感染作用利用CRISPR-Cas9技术,分别设计chTLR5和chMyD88相应的gRNAs,将gRNAs与慢病毒载体pLenti-CRISPRv2相连接获得gRNA重组病毒载体。包装慢病毒并感染鸡HD11细胞,经过嘌呤霉素筛选,获得基因敲除稳定HD11细胞系。将构建好的chTLR5KO、chMyD88KO和载体对照HD11稳定细胞分别用于S.T、VSV-GFP和NDV-RFP感染分析。结果显示,与对照细胞相比,chTLR5 KO和chMyD88 KO细胞中S.T增殖水平显著上升,而相关细胞因子基因表达水平下降。VSV和NDV在chTLR5 KO和chMyD88 KO HD11细胞中的复制水平上升,细胞下游抗病毒相关因子和炎症因子基因表达水平有不同程度的下降。以上结果说明内源性chTLR5和chMyD88在宿主细胞受到包括细菌和病毒在内的病原侵袭时发挥一定的防御作用。5 chMyD88的原核表达及单克隆抗体的制备将中间重组载体pENTR4-chMyD88-3FLAG通过LR位点特异重组连接到目的表达载体pDEST527获得重组原核表达载体pDEST527-chMyD88-3FLAG。转化到DE3/BL21细菌并诱导蛋白表达,Western bloting检测蛋白的正确表达。选择最佳优化条件从细菌包涵体中纯化chMyD88可溶性蛋白。将目的chMyD88纯化蛋白免疫4～5周龄BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合,ELISA检测杂交瘤细胞上清获得阳性克隆株。分泌的单克隆抗体可以Western blot检测外源和内源性chMyD88蛋白表达。chMyD88单抗和多抗为chMyD88蛋白相关功能研究提供实验材料和工具。