家禽常被用作发育生物学研究的动物模型,很多研究致力在更深层次揭示家禽发育的机理,尤其是生殖系统的发育,在内源性调节的基础上试图通过外源性调控,以提高家禽的繁殖性能。本实验以艾维因鸡胚为材料,分离了胚胎期原始生殖细胞(primordial germ cell,PGC),并进行原代和传代培养,研究了表皮生长因子(EGF)、雌激素(17β-estradiol)和人参皂甙对PGC增殖的作用及其胞内信号传导机制,同时还探索了维甲酸(RA)在PGC减数分裂启动过程中的调控作用。为改善家禽繁殖性能的营养调控、转基因家禽的制备提供理论依据和实验平台。1.鸡胚PGC的分离、培养及鉴定在体视显微镜下用玻璃针分离19期3.5d鸡胚生殖嵴部位(去除头突、心脏、尿囊膜和尾部,取后肠前1/3的背外侧组织)或28期5.5d鸡胚性腺(从中肾中剥离出来),胰蛋白酶+EDTA消化分散组织,用含10%胎牛血清和10 ng/ml白血病抑制因子(LIF)的KO-DMEM培养液体外共培养PGC和体细胞的方式建立原代培养,然后传代培养于鸡胚成纤维细胞饲养层上进行进一步培养。同时我们从13-15期鸡胚血管中分离提取PGC进行原代和饲养层上传代培养。传至3-5代后,分离PGC集落,用碱性磷酸酶(AKP)、过碘酸雪夫氏(PAS)化学反应及c-kit、SSEA-1,3,4、EMA-1等免疫细胞化学鉴定PGC,用BrdU掺入法检测细胞的增殖活性。并采用RT-PCR方法检测干细胞多能性相关基因(Pou5fl, Sox2, Nanog, AP和Tert),生殖细胞特异性基因(c-kit, Vasa和Dazl)和减数分裂标记基因(Stra8和Scyp3)。上述结果表明PGC-体细胞原代共培养再传代于饲养层上培养的模型是可以用于PGC增殖活性调控的研究。2.EGF对鸡胚PGC增殖的影响及其机理的研究本实验研究了EGF对鸡胚PGC增殖的影响及其相关的信号传递途径。结果表明：经过EGF(10-100 ng/m1)处理后,PGC的克隆数目和面积呈时间和剂量依赖性显著增加。EGF激活蛋白激酶C (PKC),但是这种作用被EGF受体磷酸化抑制剂AG1478及细胞内钙离子螯合剂EGTA所阻断。此外,EGF还能促进细胞核因子NF-κB (p65)核转位及IkBα的降解,但此效应均可被AG1478, EGTA,H7(PKC抑制剂)及SN50(NF-κB特异性抑制剂)所抑制。实验还表明EGF诱导的PGC促增殖作用分别被AG1478, EGTA, H7及SN50显著抑制。EGF能促进细胞周期蛋白Cyclin Dl/周期蛋白依赖激酶CDK6, Cyclin E/CDK2及凋亡抑制因子Bcl-2的表达：同时,下调促凋亡因子Bax的表达,抑制细胞凋亡蛋白酶3/9的活性,并且这些作用都被AG1478, EGTA, H7和SN50阻断。从而说明EGFR, PKC, NF-κB信号通路介导EGF诱导的DNA合成及抗凋亡作用。以上结果表明：在体外培养条件下,EGF能过Ca2+/PKC, NF-κB信号途径促进鸡胚PGC的增殖,揭示EGF信号通路在调控鸡胚胎生殖细胞发育中起着重要的作用。3.雌激素对鸡胚PGC增殖调控机理的研究我们研究了17p-雌二醇(E2)对鸡胚PGC增殖的影响,以及GPR30介导的具体的信号转导途径。结果表明,向0日龄鸡蛋卵黄中注射E2,在5天性腺(27期)中我们发现SSEA-1阳性细胞数明显高于对照组(注射DMSO)。在体外培养模型中,我们首次发现第5天性腺PGC表达GPR30,但并不表达传统的雌激素受体ERα和ERβ。1-100 nM E2以剂量依赖和时间依赖模式显著增加PGC克隆团的数量和面积。Western blot分析显示E2能激活PGC中Akt活性,GSK3β和β-连环蛋白的磷酸化水平,这些刺激作用分别被AG1478, LY294002(P13K抑制剂),KP372-1(Akt抑制剂)和GPR30 SiRNA所阻断,但是ER抑制剂ICI182,780并没有明显的抑制作用。我们还发现E2对PGC克隆团数目和面积的正调控作用被AG1478, LY294002, KP372-1和GPR30 SiRNA抑制,但被GPR30激活剂G-1和GSK3β抑制剂BIO所提高。Real-time RT-PCR结果显示,E2显著上调PGC中细胞周期蛋白cyclinDl/E,CDK2/6和原癌基因c-fos, c-myc的mRNA丰度,但是这种上调作用被AG1478、Y294002、KP372-1和GPR30 SiRNA抑制。综上所述,E2通过GPR30, EGFR, PI3K/Akt和GSK3β/β-连环蛋白信号级联反应刺激鸡胚性腺PGC的增殖。这些发现提示,E2/GPR30信号在性腺分化前生殖细胞发育中扮演重要的调控作用。4.人参皂甙对鸡胚PGC增殖的调控及其机制的研究我们就人参皂甙(ginsenosides)对鸡胚PGC的促增殖作用及所涉及的NF-kB信号途径进行研究。从3.5-4天的鸡胚中分离PGC,在添加5%胎牛血清和10 ng/ml的LIF的DMEM培养液中进行原代培养24小时。传代培养于饲养层上的PGC,用人参皂甙单独处理,或联合PKC抑制剂H7或激活剂佛波酯(PMA)处理24h。此外,通过Western blot分析了NF-κB的核转移和IκBα的降解水平。结果表明,1-100μg/ml人参皂甙以剂量依赖方式显著增加了PGC克隆团的数量和面积,但是这种正调控作用明显被10-6M的H7抑制。同时PKC免疫组化结果显示,经过人参皂甙处理后,PGC克隆团中大部分PKC转移到细胞膜上着色,说明PKC已被激活。并且,1-10μg/ml人参皂甙刺激NF-κB (p65)从PGC胞质向细胞核转移。然而,人参皂甙诱导的NF-κB核转移和IκBα降解作用被10-6M的H7显著阻断。以上结果揭示,人参皂甙能通过激活PKC/NF-κB信号途径促进鸡胚PGC的增殖。5.维甲酸(RA)对鸡胚PGC减数分裂的影响本实验我们以在体外长期培养的血液PGC为研究对象,探索RA在调控鸡胚胎期生殖细胞减数分裂中是否起着保守作用,及其RA能否直接作用于PGC上。结果表明,在27期鸡胚性腺体外培养体系中添加RA能明显使减数分裂相关基因Stra8, Sycp3和Dmcl的mRNA表达水平上调。在血液PGC无饲养层的培养模型中,RA急剧上调雌性和雄性PGC中Stra8, Sycp3和Dmcl的mRNA表达水平。流式分析结果显示,PGC经过RA处理4天后,29.5%雄性PGC和58.7%雌性PGC处于亚G1期(1n),说明此部分细胞已经进入减数分裂期。吉姆萨染色结果表明雄性PGC和雌性PGC在经RA诱导进入减数分裂偶线期和粗线期的能力不一样,雌性PGC在RA的诱导下更易进入偶线期和粗线期。综上所述,我们首次报道了RA能直接作用于PGC上从而刺激PGC进入减数分裂期,其中雌性PGC更易进入减数分裂。以上实验结果表明：从不同时期鸡胚分离出来的PGC进行原代共培养,再传代于鸡胚成纤维细胞饲养层上所建立的传代PGC培养模型可用于PGC增殖和分化调控的研究,经AKP、PAS及c-kit和SSEA-1、3、4免疫细胞化学染色等多种方法证实了PGC的原始性。在此模型上发现内源性因子EGF和外源性植物提取物人参皂甙在PGC体外扩增中的有丝分裂原作用及其分子机理；首次报道新型雌激素受体GPR30在鸡胚性腺组织和PGC中的表达情况,及其在雌激素诱导的鸡胚PGC增殖中的介导作用；同时首次证实了RA能直接促进鸡胚胎期生殖细胞进入有丝分裂。这些发现将为提高家禽繁殖性能的营养调控、制备嵌合体和转基因家禽提供理论指导和实验平台。