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研究目的探究Vp1蛋白作用于沙眼衣原体并抑制其生长的机制。研究内容研究Vp1蛋白作用于沙眼衣原体后的光镜下及免疫荧光镜下的变化;研究Vp1蛋白作用于沙眼衣原体后不同时间点MEK/ERK通路p-ERK1/2蛋白的改变,ERK1和ERK2基因的改变,IL-1和IL-8炎性因子的改变;研究Vp1蛋白与阿奇霉素作用于沙眼衣原体后的区别与联系;研究Vp1蛋白作用于沙眼衣原体后三型分泌系统的改变;研究Vp1蛋白作用于沙眼衣原体后对其生长周期的影响。研究方法对构建的重组质粒菌Vp1-Pet30a(+)进行诱导表达,对表达出的Vp1蛋白进行SDS-PAGE电泳及Western Blot鉴定并纯化,纯化后的Vp1蛋白透析复性后进行蛋白定量、滤过除菌后使用。将处理后的Vp1和阿奇霉素与沙眼衣原体在Mc Coy细胞中作用,在光镜下及免疫荧光镜下观察两者对沙眼衣原体的抑制作用;提取各组细胞不同时间点的总蛋白,采用Western Blot方法检测各组之间ERK信号通路p-ERK1/2及总ERK1/2的变化情况;提取各组细胞的总RNA,采用Realtime-PCR方法检测各组之间ERK1及ERK2基因的变化情况;提取各组细胞不同时间点的培养液上清,用ELISA方法检测各组IL-1及IL-8的表达水平。应用纯化无菌的Vp1在Mc Coy细胞中作用于沙眼衣原体,同时设置未干预组和空白作为对照。培养12h、24h、36h、48h后,分别提取各组细胞的总RNA,应用Realtime-PCR方法检测沙眼衣原体内Tarp(CT456)、CT694、Inc A(CT119)、Tep P(CT875)、CT621、Cdsf(CT666)、Hct A(CT743)、Hct B(CT046)、Omc A(CT444)、Omc B(CT443)基因在不同时间点干预前后表达的不同。研究结果1、重组表达的Vp1及阿奇霉素对Mc Coy细胞内正常生长的沙眼衣原体均有抑制作用,光镜下及荧光显微镜下观察到包涵体减少,并且其减少的程度与Vp1的及阿奇霉素的浓度呈正相关。Vp1作用于沙眼衣原体后可与其结合并跟随其进行复制。2、Vp1及阿奇霉素作用于沙眼衣原体后均可引起Mc Coy细胞内MEK/ERK通路的改变,p-ERK1/2表达减少,ERK1及ERK2基因表达降低,尤以ERK1下降为显著。3、从Vp1与阿奇霉素起作用的时间来看,Vp1对沙眼衣原体的抑制作用主要发生于衣原体生长周期的后期,而阿奇霉素对沙眼衣原体的抑制作用主要发生于衣原体生长周期的早期。4、Vp1及阿奇霉素作用于沙眼衣原体后,Mc Coy细胞产生的炎症因子IL-1及IL-8减少,细胞炎症减轻。作用后,IL-1在感染后期减少明显;IL-8在Vp1干预后早期即有减少,阿奇霉素干预后感染后期减少明显。5、Vp1作用于沙眼衣原体后可导致沙眼衣原体内三型分泌系统分泌减弱。感染早期(EB侵入宿主细胞),Cdsf(CT666)表达下调,使EB对宿主细胞的感染能力下降。感染后期(即RB转为EB时期),Tarp(CT456)、CT694表达水平降低,衣原体的侵袭能力下降。Inc A(CT119)表达水平上升,衣原体同型融合增多,RB不断融合形成异常增大的网状体。Cdsf(CT666)、CT621表达下调,可使RB转化为EB减少。Tep P(CT875)在整个生长周期中表达水平均降低,提示Vp1可能干预衣原体与宿主细胞之间的信号通路传递,干扰包涵体形成。其可能还参与免疫相关基因的调控,使宿主细胞对衣原体的免疫反应增强,从而达到抑制衣原体生长的目的。6、Vp1作用于沙眼衣原体后,可导致沙眼衣原体生长周期晚期表达的基因水平下调。Hct A(CT743)、Hct B(CT046)、Omc A(CT444)、Omc B(CT443)在Vp1作用于沙眼衣原体后的晚期表达均较为干预组有所下降,提示Vp1可能通过某种机制抑制了沙眼衣原体生长周期晚期表达的基因,从而影响RB向EB的转化,抑制沙眼衣原体的增殖。结论Vp1蛋白可能通过干扰沙眼衣原体生长的后期RB转化为EB过程来抑制其生长。