粘质沙雷氏菌杀虫蛋白的分离纯化及其基因的克隆与表达研究

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蝗虫是一种主要的草地害虫,对我国农牧业的造成了极大的损失,我国目前控制蝗虫危害的手段主要是采用化学药剂来降低虫口密度,但是过度的使用化学农药对环境造成了相当的危害,迫切需要采用一些生物防治手段来作为替代。因此,蝗虫的生物防治技术应运而生,并日益受到重视。 本实验从蝗虫自然病死虫尸中分离纯化得到一较高毒性的病原菌HR-3,通过形态学观察、生理生化特征分析和分子鉴定将其鉴定为为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens),为细菌杀虫剂的研究开发提供了新的菌株来源。微生物杀虫剂由于所使用的病原微生物不同,其杀虫原理和机制有所不同,粘质沙雷氏菌HR-3的杀虫活性实验表明,其杀虫活性物质是存在于细菌上清液中的杀虫蛋白。将细菌发酵上清液进行Milipore超滤,除去40kDa以下和80kDa以上的蛋白,获得40-80kDa的杀虫粗蛋白。进一步经过硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析,Sephacryl S-200凝胶过滤,获得电泳纯的杀虫蛋白。每升发酵液中可获得约10ml杀虫蛋白溶液,冻干可获得4.5mg活性蛋白,SDS-PAGE电泳和凝胶过滤实验表明该杀虫蛋白为单体,分子量约为60kDa。 粘质沙雷氏菌分泌的许多著名的胞外蛋白,分别为核酸酶、磷脂酶、溶血素、含铁细胞、几丁质酶、含铁细胞、蛋白酶、脂肪酶,其中的一种或几种蛋白有可能是杀虫活力因子。通过酶活检测结果表明,纯化的杀虫蛋白仅具备蛋白酶活性,杀虫蛋白应是一种蛋白酶。用EDTA和1-10-phenanthrolin可以抑制杀
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