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黄酒是我国传统酿造食品,因其独特的风味和丰富的营养物质广受消费者喜爱。但研究发现发酵酒精饮品中存在氨基甲酸乙酯,并且对试验动物造成多位点致癌。2007年国际癌症研究机构(IARC)将氨基甲酸乙酯提升为对人类具有潜在致癌性的物质(2A级别)。因为发酵饮品中氨基甲酸乙酯会对饮酒人群的健康造成威胁,所以对氨基甲酸乙酯的安全调控是目前黄酒酿造中面临的主要科学难题。黄酒中氨基甲酸乙酯形成的主要前体物为尿素,并且尿素主要来源于发酵原料和发酵后期酿酒酵母对精氨酸的降解,而精氨酸的代谢主要受氮代谢抑制的调控。本研究将基于氮代谢抑制调控机制来探究黄酒中氨基甲酸乙酯的调控途径。主要研究结果和结论如下：(1)酿造后期添加硫酸铵作为补充氮源,并且对酿造过程中精氨酸浓度、尿素浓度、氨基甲酸乙酯浓度,和酿造产品中酒精度、风味物质组成、氨基酸组成的测定结果表明：发酵20天时添加5 g/L硫酸铵使发酵液中精氨酸浓度明显比不添加硫酸铵的对照组浓度高,尿素与氨基甲酸乙酯的浓度分别比对照组降低24%和16%,发酵产品的酒精度、风味物质组成以及氨基酸组成与对照组差异不大。采用酿酒酵母BY4741和SC替代酒药(对照组)进行酿造,并且对酿造过程中精氨酸浓度、尿素浓度、氨基甲酸乙酯浓度,和酿造产品中酒精度、风味物质组成、氨基酸组成的测定结果表明：酿造过程中精氨酸浓度始终低于对照组,而尿素和氨基甲酸乙酯的浓度与对照组中差异不大,发酵产品的酒精度、风味物质组成以及氨基酸组成差异不大。因此,在后续的研究中可以应用酿酒酵母BY4741和SC替代酒药作为研究对象,来探究氨基甲酸乙酯形成的分子学基础。(2)应用转录组学分析方法对三种不同培养条件下的酿酒酵母氮代谢相关基因进行分析,高氮水平组中基因表达水平作为参照(低氮水平组： YNB培养基中添加2mM硫酸铵和 20mM精氨酸；高氮水平组：YNB培养基中添加40mM硫酸铵和20mM精氨酸；添加雷帕霉素组,YNB培养基中添加40mmM硫酸铵、20mM精氨酸和20nM雷帕霉素)。结果表明：1.低氮处理(低氮组vs高氮组)和添加雷帕霉素处理(雷帕霉素组vs高氮组)条件下,差异基因富集的代谢通路都主要包括碳水化合物代谢和氨基酸代谢。2.在低氮条件下(低氮组vs高氮组),大部分受氮代谢抑制调控的基因转录水平均有提高,这与报道中脯氨酸作为唯一氨基酸氮源时相关基因的转录水平一致。3.低氮处理(低氮组vs高氮组)和添加雷帕霉素处理(雷帕霉素组vs高氮组)条件下差异表达基因仅有少量基因转录水平变化一致(69个基因上调表达,9个基因下调表达),说明TOR信号途径和氮代谢抑制之间是两条平行的代谢通路。4.在低氮条件下,氮代谢抑制调控机制的四个转录因子中仅有Da180p表达量显著提高,基于已有报道中Da180p对DUR1,2的转录抑制作用,本研究将Da180p作为氨基甲酸乙酯的潜在调控因子。(3)对Da180p与G1n3p锌指结构域的三级结构比对结果表明,Da180p与Gln3p的核酸结合域高度同源。Da180p分别与CAR1和DUR1,2的凝胶迁移实验(EMSA)表明Da180p对精氨酸降解酶编码基因CAR1结合作用较弱,而对于尿素降解酶编码基因DUR1,2结合作用较强,这说明Da180p对尿素降解酶具有转录抑制作用。(4)以DAL80敲除菌为研究对象,开展在低氮模拟发酵体系中的氮代谢水平研究,对酵母细胞生长曲线、精氨酸浓度、尿素浓度、精氨酸酶活性、脲酶活性、荧光定量PCR测定结果表明：1.BY4741和DAL80敲除菌分别在低氮和高氮条件下,酵母细胞生长曲线差异性不大,这说明敲除DAL80基因不影响酵母的生长性能。2.DAL80敲除菌在低氮条件下,精氨酸酶活略高,但发酵液中精氨酸含量与高氮源条件下差异不大,脲酶活性保持较高水平不受发酵液中氮源浓度影响,发酵液中尿素浓度在低氮和高氮下均较低。3.RT-PCR结果表明敲除DAL80基因能够提高GAP1、 DUR1,2、DUR3的转录水平,而对CAR1的转录水平影响不大,该研究结果与凝胶迁移实验结果一致。综上所述,敲除DAL80不影响酵母细胞的生长性能,而且能够解除Da180p对脲酶的抑制作用。应用DAL80敲除菌部分替代或者完全替代传统酒药进行酿造试验,对发酵液中尿素浓度、精氨酸浓度、氨基甲酸乙酯浓度,和酿造产品中酒精度、风味物质组成、氨基酸组成的测定结果表明：1.DAL80敲除菌部分替代或者完全替代酒药酿造时,发酵液中精氨酸浓度与BY4741未敲除酿造组水平差异不明显。2.尿素浓度和氨基甲酸乙酯浓度均比酒药发酵组和BY4741未敲除酿造组略低,发酵30天后氨基甲酸乙酯分别降低19.6%和38.5%。3.酿造产品中酒精度、风味物质组成、氨基酸组成与酒药酿造组差异不明显。基于该研究结果,应用DAL80敲除菌替代酒药进行酿造能有效抑制氨基甲酸乙酯的形成,同时不影响酿造产品的品质。本研究首先基于转录组学分析筛选出Da180p作为氨基甲酸乙酯产生的潜在抑制因子；然后通过蛋白质与核酸结合实验、DAL80敲除菌的代谢基础研究阐明Da180p对尿素代谢的调控机制,为DAL80敲除菌应用于黄酒酿造提供理论基础；最后将DAL80敲除菌应用于黄酒酿造试验,研究结果表明敲除DAL80能有效降低酿造产品中氨基甲酸乙酯的浓度,并对酿造产品品质无负面影响。