【摘 要】
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目的:FGFR信号通路异常在中国人群结直肠癌中的比例接近30%,FGFR信号通路异常与结直肠癌发生发展及预后不良相关,课题组前期初步分析发现PAI-1表达可能与FGFR信号通路相关。本研究旨在进一步探索FGF/FGFR2信号通路对结肠癌PAI-1表达的调控机制,并探索PAI-1对结肠癌免疫微环境的影响。方法:（1）通过TCGA和GEO数据库（GSE164191）获取结直肠癌患者表达谱数据及对应临床
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（No.81372664）； 华中科技大学双一流自主创新学科医师资助项目（No.3011540024,No.5001540074,No.5001540095）； 武汉市中青年医学骨干人才培养工程（2016whzqnyxggrcl）； 湖北省医学青年拔尖人才项目（No.202
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目的:FGFR信号通路异常在中国人群结直肠癌中的比例接近30%,FGFR信号通路异常与结直肠癌发生发展及预后不良相关,课题组前期初步分析发现PAI-1表达可能与FGFR信号通路相关。本研究旨在进一步探索FGF/FGFR2信号通路对结肠癌PAI-1表达的调控机制,并探索PAI-1对结肠癌免疫微环境的影响。方法:（1）通过TCGA和GEO数据库（GSE164191）获取结直肠癌患者表达谱数据及对应临床数据,分析PAI-1在结直肠癌和正常组织中m RNA表达差异,以及PAI-1对结直肠癌进展和预后的影响。通过GEPIA在线数据库分析结直肠癌患者FGFR2和PAI-1基因表达相关性。（2）培养FGFR2高表达细胞系NCI-H716和FGFR2低表达细胞系SW480,通过转染慢病毒使前者沉默FGFR2,后者过表达FGFR2。通过q RTPCR,Western Blot,ELISA检测PAI-1表达水平。（3）对SW480-FGFR2细胞和SW480-Vector细胞进行RNA-seq及GSEA-KEGG分析,并用FGF7刺激细胞,检测FGFR、STAT3、JAK2以及相应磷酸化蛋白的表达水平。细胞被FGF7刺激后,接着用含不同浓度AG490培养基继续培养24 h,或用含10μM AG490培养基培养不同时间段,检测PAI-1表达水平变化。（4）通过TISCH、Link Omics、以及TIMER等多个在线数据库分析PAI-1与免疫细胞的相关性以及对巨噬细胞极化的影响。（5）用SW480-FGFR2细胞和SW480-Vector细胞培养上清或含有不同浓度人源重组PAI-1活性因子的培养基作为条件培养基刺激巨噬细胞（THP-1,U937）,提取巨噬细胞RNA、蛋白,对M1/M2标志蛋白进行检测。（6）用裸鼠建立异种移植皮下肿瘤模型,分为Vector组、FGFR2-OVE组、以及FGFR2+PAI-039（Tiplaxtinin）处理组,每三天测量肿瘤体积,三周后处死小鼠取眼球血和肿瘤,ELISA检测外周血中PAI-1含量,免疫组化检测肿瘤组织FGFR2和PAI-1表达,以及肿瘤巨噬细胞M2标志物CD206表达,流式细胞术检测巨噬细胞的极化。（7）建立小鼠皮下瘤模型,分为对照组,PAI-039组,αPD-1组和联合给药组,隔天测量肿瘤体积以及小鼠体重,给药两周后处死小鼠取眼球血、肿瘤、心肝脾等主要脏器。测肿瘤体积及重量比较各组间疗效,血生化以及主要脏器标本H＆E染色评估药物安全性,流式细胞术分析肿瘤免疫微环境。结果:（1）结直肠癌组织中PAI-1表达水平均高于癌旁组织（P＜0.05）且PAI-1表达与不良预后相关。结直肠癌中FGFR2与PAI-1 m RNA表达水平呈显著正相关（r=0.14,P=0.018）。（2）两种结肠癌细胞系中FGFR2与PAI-1表达水平均正相关。（3）转录组测序KEGG分析结果显示,FGFR2过表达后在JAK/STAT通路显著富集（NES=1.454,P=0.018）。结直肠癌细胞中FGFR2激活可通过JAK/STAT3信号通路促进肿瘤细胞PAI-1表达。（4）生信分析显示PAI-1与巨噬细胞活化及向M2极化相关。（5）FGFR2过表达细胞系更易诱导巨噬细胞向M2极化。（6）裸鼠皮下瘤模型中,FGFR2过表达组肿瘤体积、肿瘤组织PAI-1表达、外周血PAI-1含量、肿瘤巨噬细胞CD206表达均高于对照组和PAI-1抑制剂处理组。（7）与单独使用PAI-1抑制剂和抗PD-1两种药物相比,联合用药抗肿瘤效果更优。结论:结直肠癌中PAI-1表达升高,且在基因和蛋白水平与FGFR2表达均呈正相关。FGF/FGFR2信号通过JAK/STAT3调控结肠癌细胞PAI-1的表达,并诱导M2巨噬细胞极化,从而影响肿瘤微环境,造成免疫抑制。同时,PAI-1抑制剂和抗PD-1联合治疗是一种有潜力的结肠癌治疗方法。
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