【摘 要】
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目的:p21是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂家族中的重要成员。研究表明,p21可以调节多种肿瘤对化疗药物的耐药和敏感性。本文主要研究了p21在结直肠癌（Colorectal carcinoma,CRC）中的特征,以及p21表达水平对氯喹（Chloroquine,CQ）诱导细胞死亡的影响和机制。方法:（1）通过多种生物信息数据库网站的分析和人结肠癌组织芯片免疫组织化学（Immunohistochemi
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目的:p21是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂家族中的重要成员。研究表明,p21可以调节多种肿瘤对化疗药物的耐药和敏感性。本文主要研究了p21在结直肠癌（Colorectal carcinoma,CRC）中的特征,以及p21表达水平对氯喹（Chloroquine,CQ）诱导细胞死亡的影响和机制。方法:（1）通过多种生物信息数据库网站的分析和人结肠癌组织芯片免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色,检验p21在CRC病人中的表达水平及其与患者临床特征的相关性;（2）使用sh RNA或者删除同源等位基因的方法构建p21低表达的HCT116人结肠癌细胞系,通过蛋白印迹、台盼蓝染色和流式细胞术等方法检测其对经CQ处理后的细胞死亡的影响;（3）通过多种生物信息数据库网站的分析和人结肠癌组织芯片IHC染色,检验p62在CRC病人中的表达水平,分析p21与自噬相关分子p62、LC3等表达的关系。使用sh RNA分别在p21-/-HCT116细胞中敲低自噬起始相关分子ULK1、Beclin1、Atg7和Atg5等,通过蛋白印迹、台盼蓝染色、克隆形成及绿色荧光蛋白（Green fluorescent proteins,GFP）-LC3融合蛋白等方法,观察CQ诱导的p21-/-HCT116细胞死亡变化;（4）过表达抗凋亡因子Bcl-2或用广谱半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK处理p21-/-HCT116细胞,检测CQ处理后的细胞死亡。用sh RNA或删除同源等位基因的方法在p21-/-HCT116细胞中分别下调p53和PUMA,检测经CQ处理后细胞死亡;（5）用3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）预处理p21-/-HCT116细胞后检测经CQ诱导的细胞死亡比例。通过蛋白印迹检测LC3-II和观察GFP-LC3荧光,观察经CQ诱导不同时间的p53+/+、p53-/-、p21-/-和PUMA-/-p21-/-等不同基因型HCT116细胞的自噬体水平;（6）在野生型HCT116细胞和p21-/-HCT116细胞中使用抗氧化物质处理后再用CQ处理,通过台盼蓝染色和GFP-LC3荧光检测细胞死亡和自噬体,验证该过程是否与氧化应激有关;（7）将p21缺失的HCT116细胞或敲除APC的HCT16细胞种植到SCID小鼠侧腹皮下形成异种移植瘤后,将小鼠随机分为对照组和CQ治疗组。每周测量肿瘤体积,治疗结束后,处死小鼠并分离出肿瘤组织进行拍照、称重和免疫组化染色,以评估CQ在体内对p21缺失的结肠肿瘤生长的影响。结果:（1）p21在CRC组织中表达下调,且p21低表达患者生存期更短;（2）下调p21能使CQ诱导的HCT116细胞死亡明显增多;（3）p62在CRC组织中表达增多,p21与p62的表达呈正相关。分别在p21-/-HCT116细胞中敲低ULK1、Beclin1、Atg7和Atg5等,CQ诱导的PARP裂解减少,细胞集落更多,GFP-LC3荧光斑点减少,说明CQ诱导的p21-/-HCT116细胞死亡增多需要自噬参与;（4）抑制凋亡及p53或PUMA的表达后,CQ诱导的p21-/-HCT116细胞死亡减少,说明该过程是需要p53和PUMA的参与的凋亡;（5）3-MA预处理p21-/-HCT116细胞后,经CQ诱导的细胞死亡减少。p21-/-HCT116细胞经CQ处理后LC3-II表达增多,且出现了更早和更明显的GFP-LC3荧光斑点。说明p21缺失增敏CQ诱导的HCT116细胞凋亡需要自噬体积累;（6）用抗氧化物质预处理p21+/+和p21-/-HCT116细胞后,CQ诱导的细胞死亡明显减少,GFP-LC3荧光斑点减少。说明CQ可能是通过抑制自噬介导的氧化应激产物活性氧（Reactive oxygen species,ROS）清除,引起p21-/-HCT116细胞死亡增多的;（7）体内实验证实,CQ对p21缺失的HCT116细胞构建的小鼠异种移植瘤的抑制作用更明显。结论:在CRC中,p21的缺失能增加经CQ诱导的细胞死亡。CQ通过抑制自噬活性,促进自噬小体和ROS的积累,从而增加细胞凋亡,提高在p21低表达的CRC中的抗肿瘤疗效。本研究为在p21低表达的CRC患者中应用CQ以改善疗效和预后提供了一种有希望的选择。
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