极端嗜盐曲霉核糖体蛋白基因SpRPS3ae和SpRPL44的克隆及其抗逆功能研究

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核糖体蛋白作为构成核糖体的主要成分,生物体内高度保守。核糖体蛋白基因除了参与细胞内蛋白质的生物合成之外,还具有DNA的修复功能、基因转录调控、细胞的发育调控以及细胞的分化调节等核糖体外的功能。此外,其与肿瘤、先天性疾病有一定的关系。本实验中材料是一株从晒盐场的周边风干野生植被表面分离和筛选得到极端嗜盐曲霉(Aspergillus sp.),命名为CCHA。作为一种具有嗜盐性的物种,对外界环境的适应能力比较强,推测在极端嗜盐曲霉CCHA中存在多抗基因。本研究中利用本实验室构建的一株极端嗜盐曲霉CCHA酵母表达文库,从文库中筛选并克隆了曲霉40s核糖体蛋白基因SpRPS3ae和60s核糖体蛋白基因SpRPL44。SpRPS3ae和SpRPL44基因序列ORF分别包含768bp和321bp,分别编码256和107个氨基酸,分子量大小分别为29.15kDa和12.09kDa。将SpRPS3ae和SpRPL44进行酵母的转化,发现SpRPS3ae和SpRPL44基因能提高菌株的抗盐能力。为了验证SpRPS3ae和SpRPL44基因的功能,将SpRPS3ae和SpRPL44基因转入稻瘟菌,并进行逆境胁迫实验。结果发现SpRPS3ae和SpRPL44能够提高转基因稻瘟菌的抗盐性,使转基因稻瘟菌对过氧化氢的耐受力增强,敏感性降低,其在耐干旱和保护细胞膜方面也有一定的作用。为了进一步探究核糖体蛋白基因RPS3ae和RPL44的抗逆功能,我们克隆获得了稻瘟菌本身的核糖体蛋白基因MoRPS3ae和MoRPL44,并进行了酵母转化。将获得的四种转基因酵母阳性转化子(转SpRPS3ae和SpRPL44,转MoRPS3ae和MoRPL44),野生型酵母菌株(GS115)同时进行盐胁迫实验,发现转基因的阳性酵母转化子和野生型酵母相比具有抗盐性。同时发现,在相同盐胁迫条件下,转极端嗜盐曲霉SpRPS3ae和SpRPL44的酵母转化子比稻瘟菌MoRPS3ae和MoRPL44的酵母转化子具有更强生活力。为了揭示SpRPS3ae和SpRPL44基因在植物中的功能,将SpRPS3ae和SpRPL44利用叶盘转化法转染烟草,并对转基因植物进行人工模拟的盐胁迫实验,初步验证转基因烟草植株对盐渍胁迫的耐受性明显高于野生型的植株。通过农杆菌(ATMT)介导转化的方法对拟南芥进行侵染转化,获T2代的转基因拟南芥,为下一步在拟南芥中验证SpRPS3ae和SpRPL44基因的功能奠定了基础。
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