目的:探讨具有疏肝健脾、活血化瘀功效的肝积方对于肝郁脾虚型人肝癌HepG2荷瘤鼠瘤体重量和体积的抑制作用、对荷瘤鼠肝脏指数、脾脏指数的影响及对瘤体组织Bax、Bcl-2、Caspase-3凋亡相关蛋白表达的影响。临床选取肝郁脾虚型肝癌患者,评估肝积方对于其临床症状积分、KPS评分、肝功能分级及CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、mHLADR、CD64⁺等免疫指标的影响。通过病症结合荷瘤动物实验及临床研究初步探讨肝积方的临床疗效及其可能作用机制。方法:1.动物实验研究1.1肝郁脾虚证动物模型建立及分组造模方法:采用随机方法将32只BALB/c裸鼠分为模型组和对照组,各16只。32只BALB/c裸鼠按随机分为模型组（16只）与对照组（16只）,模型组采用“慢性束缚应激⁺过度疲劳⁺饮食失节法”复合应激刺激连续造模28天,具体造模方法参照^[1]报道:将裸鼠置于10ml束缚注射器中从每天上午8:00开始限制3小时,下午2:00裸鼠置于大塑料桶中游泳10min,水温为25±1°C。喂食方法为:隔日喂食高脂高胆固醇饲料（若首日禁食,则次日足量给食,循环往复）。对照组不予干预,予普通饲料,自由进食饮水。观察各组裸鼠的一般情况、体重、进食量是否变化、悬尾不动时间等行为学指标,评估肝郁脾虚证裸鼠模型建立成功。实验分组及给药:模型组裸鼠随机分为模型肝积方组（MG）、模型盐水组（MN）,16只对照组随机分为对照肝积方组（CG）、对照盐水组（CN）,每组8只,四组均建立人肝癌HepG2细胞株移植荷瘤裸鼠模型,MG组和CG组每日予肝积方灌胃给药,计算裸鼠等效给药剂量为28.6g/kg,MN组和CN组予每日1次,持续30天,等体积生理盐水灌胃,每日1次,持续30天。1.2各组荷瘤鼠一般情况、体重与进食量观察一般情况:每日观察并记录各组裸鼠的精神状态、姿势、皮肤色泽、活动度、眼裂黏膜色泽、耳廓色泽以及粪便等一般情况。体重变化:每日上午8:00用电子天平称量各组裸鼠体重,并绘制体重生长曲线。进食量变化:每日上午8:30观察每笼裸鼠24h内的进食量,连续观察28天。实验前检查饲养笼,确保饲料盒稳定,无漏料空隙。记录每笼裸鼠进食量,并除以裸鼠数量,得到平均每只裸鼠进食量并记录。每天同一时间给裸鼠添加饲料,24h后对裸鼠剩余的饲料进行称重。进食量（g）=加料量（g）-剩余量（g）。1.3各组荷瘤鼠瘤体重量、体积评估每5日观察并记录瘤体大小、活动度、硬度等肿瘤生长情况;测量方法:使用游标卡尺在体外分别测量瘤体长径（a）、宽径（b）及高（c）,体积计算公式:V=πabc/6。实验结束后完整剥离肿瘤并秤取瘤体重量,并根据抑瘤率计算公式=（对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/对照组瘤重×100%,计算抑瘤率。并使用游标卡尺测量瘤体大小,根据体积公式计算体积,并绘制瘤体体积生长曲线。1.4各组荷瘤鼠肝脏指数、脾脏指数的计算实验结束后无菌取出脾脏、肝脏后使用电子天平秤取荷瘤鼠体重及肝脾重量,根据器官指数计算公式=10×器官重量（g）/体重（g）,计算肝脏指数、脾脏指数。1.5 Bax、Bcl-2、Caspase-3凋亡相关蛋白检测国外学者检测肝积方对Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达水平的影响。实验结束后无菌取出瘤体切成碎片,配制成组织匀浆液,采用RIPA裂解液,提取各组细胞总蛋白,采用BCA蛋白定量试剂盒对各组细胞总蛋白进行定量。灌制10%分离胶,5%浓缩胶的SDS-PAGE凝胶电泳。每孔加入60μg蛋白,恒压80V,待溴酚蓝进入分离胶,将电压提到120V,直至溴酚蓝到达分离胶底部。300mA恒流湿转将蛋白由凝胶转到PVDF膜上。5%的BSA室温封闭2h,TBST洗涤后将PVDF膜放入1:1000稀释的抗体溶液中,4°C孵育过夜,洗涤后,加入1:2000稀释的二抗溶液,室温2h,洗涤后,将增强化学发光液（ECL）均匀涂于PVDF膜表面,暗室内放入X光片夹中曝光,显影,定影。Western blot结果使用光密度测量计扫描,使用Quantity One分析软件进行灰度值比较,以β-actin为内参,计算Bax、bcl-2、Caspase-3的相对表达量。2.临床研究2.1纳入、排除标准及分组2.1.1纳入标准:（1）原发性肝癌患者中医辨证分型为肝脾脾虚型,且经临床或病理学确诊;（2）患者年龄限制为18至75岁;（3）患者预定生存期大于3个月;（4）患Karnofsky≥50分;（5）在研究期间未接受其他有效抗肿瘤疗法者;（6）依从性好,配合改研究。2.1.2排除标准:（1）其他肿瘤转移至肝脏或者患者合并其他肿瘤;（2）近1月内患者曾进行手术、放疗、化疗、靶向治疗或者TACE有效抗肿瘤疗法者;（3）患者同时出现全身的急慢性感染,且病灶未被控制者;（4）出现严重并发症或者合并重要脏器功能损害者。2.1.3分组情况:选取广州中医药大学第一附属医院门诊及住院部2017年3月1日至2018年3月1日肝郁脾虚型原发性肝癌患者共40例,研究方法采用前瞻性、随机、对照将40例患者分别分为治疗组和对照组,各20例,治疗组予肝积方,水煎服口,日一剂,共30土2天,对照组不予中药汤剂,两组均予医学宣教、心理疏导。2.2临床症状积分量表分别于治疗前后（30土2天）对两组患者进行临床症状积分量表评估。原发性肝癌症状分级标准、中医肝郁脾虚证证型诊断标准均参照国家药监局组织编写的《中药新药临床研究指导原则（试行）》（附录5:原发性肝癌症状分级量化表）、（附录6:肝郁脾虚证症状分级量化表）。通过以上分级量化表观察治疗后患者的胁肋胀痛、情志不畅、嗳气、痞闷不畅、腹胀、纳呆、大便等肝郁脾虚症状的改善情况。根据上述症状所占轻重比例进行观察（评分标准见附录7）。2.3 KPS评分标准分别于治疗前后（30土2天）对两组患者进行KPS评分,评分标准参照Karnofsky标准（附录4）进行评价。2.4肝功能分级在治疗前后（30土2天）对两组患者各进行1次肝功能评定,评估方法参见Child-Pugh评分方法（附录8）。2.5相关免疫指标分别于治疗前后（30土2天）使用流式细胞仪检测评估两组外周血免疫相关指标T淋巴细胞亚群（CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺）及mHLADR、CD64⁺、CD14⁺。3.统计学方法统计分析采用SPSS21.0,检验水准α=0.05。动物实验:两组间定量资料的比较采用两独立样本t检验,多组间定量资料的比较采用方差分析法,组间的两两比较采用LSD法。定量资料采用均值±标准差进行统计描述。临床研究:采用两独立样本t检验对治疗组和对照组进行定量资料的比较,定量资料的描述采用均值±标准差。采用卡方检验对组间分类资料进行比较,采用频数和百分比对分类治疗进行描述。两组治疗前后的比较采用配对t检验或两相关样本的秩和检验。结果:1.动物实验研究1.1肝积方对荷瘤鼠的体重、一般情况与进食量变化的影响给药前,与前期肝郁脾虚造模相关,MG组和MN组一般情况较差,且体重明显低于CG组和CN组。实验阶段的前7天各组裸鼠的行为及饮食均表现正常,而在10天后有个别MN组裸鼠受瘤体积增长影响,其体重、一般情况与进食量均出现下降,表现为消瘦,弓背,竖毛,行动迟缓,嗜睡,腹泻等,呈恶病质状,而MG组裸鼠瘤体积增长缓慢,相对MN组缓慢一般情况与进食量变换一般,CG组瘤体积增长最慢且一般情况与进食量良好,MG组和MN组肿瘤积增长速度大于CN组。整个实验过程无裸鼠发生自然死亡。1.2肝积方对瘤体重量、体积的影响MG组和MN组（肝郁脾虚模型组）的荷瘤鼠瘤体重量明显大于CG组和CN组（对照组）,四组荷瘤鼠流体重量大小（?x±s,g）排序为:MN组（2.65±0.34）>MG组（2.23±0.21）>CN组（1.54±0.13）>CG组（1.17±0.16）,四组间差异存在统计学差异（P<0.05）。通过瘤体体积生长曲线可知,瘤体大小排序为:MN组>MG组>CN组>CG组,肝郁脾虚模型组肿瘤体积更大。第15天后,MG组瘤体体积明显小于MN组（P<0.05）,第20天后,CG组瘤体体积明显小于CN组（P<0.05）,MG组与MN组之间的下降幅度比CG组与CN组更为明显。1.3肝积方对荷瘤鼠肝脏指数和脾脏指数的影响脾脏指数高低排序为:CG组>CN组>MG组>MN组,肝积方干预后CG组脾脏指数较CN组升高,MG组脾脏指数较MN组升高,在四组间无统计学差异（P>0.05）,提示提示肝郁脾虚造模使模型组CG组、CN组脾脏指数低于MG组、MN组;肝脏指数高低排序为CG组>CN组>MG组>MN组,肝积方干预后CG组肝脏指数较CN组升高,MG组肝脏指数较MN组升高,其中CG组和CN组间存在统计学差异（P<0.05）,其余各组间无统计学意义。1.4肝积方对于Bax、Bcl-2、Caspase-3凋亡蛋白表达的影响国外学者检测Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达水平。研究结果显示,MG组与MN组相比,CG组与CN组相比,肝积方能够上调Bax蛋白、Caspase-3蛋白的表达,提高Bax/bcl-2比值,下调Bcl-2蛋白的表达。2.临床研究2.1患者一般情况组间各一般情况如年龄、性别、肿瘤形状、诊断类型、病理类型、肿瘤位置、肝炎肝硬化病史、临床分期、术前手术及介入术史等的差异无统计学意义,组间存在可比性。2.2临床症状积分变化治疗后两组患者临床症状积分比较:治疗组治疗前后临床症状总积分差异存在统计学差异（P<0.001）。对照组治疗前后总积分无统计学差异（P>0.05）。总有效率方面,两组治疗后存在显著性差异（P<0.05）。说明两组具有可比性。临床肝郁脾虚症状改善方面,通过组内的前后比较结果可知,治疗组的胁肋胀痛、情绪抑郁、纳呆等症状在治疗前后存在统计学意义（P<0.05）,而对照组的各项症状指标在治疗前后未见统计学差异（P>0.05）。治疗后,治疗组和对照组组间胁肋胀痛、情绪抑郁、纳呆等指标比较亦存在统计学意义,舌脉、嗳气、痞块、腹胀、大便溏滞、消瘦乏力等指标在治疗组和对照组间的差异无统计学意义。2.3 KPS评分变化治疗后治疗组和对照组患者的KPS评分均较前有所改善,但改善未达统计学意义（P>0.05）。2.4肝功能分级变化治疗后,治疗组在治疗前后及其与对照组相比,其肝功能均未见统计学差异。2.5免疫相关指标变化外周血T淋巴细胞亚群方面,40例肝郁脾虚型肝癌治疗组和对照组患者相比:（1）经肝积方治疗后,治疗组CD8⁺T百分数下调程度可达统计学差异（P<0.05）;（2）经肝积方治疗后,治疗组外周血CD3⁺、CD4⁺T细胞上升程度可达统计学差异（P<0.05）;（3）经肝积方治疗后,治疗组患者CD4⁺/CD8⁺比值升高（P<0.05）;（4）两组CD64指数均上升,治疗前后对比未见统计学意义,两组间无统计学差异（P>0.05）;（5）经肝积方治疗后,治疗组CD3⁺/mHLADR⁺较前升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;（6）本研究中,两组mHLADR⁺/CD14均较治疗前升高,差异无统计学意义（P>0.05）。结论:动物实验研究结果表明:肝积方对人肝癌HepG2裸鼠皮下移植瘤的重量和体积有一定抑制作用,同时提高肝脏指数,并可改善荷瘤鼠进食量及减缓体重下降趋势。肝积方能够上调Bax蛋白、Caspase-3蛋白的表达,提高Bax/bcl-2比值,下调Bcl-2蛋白的表达。临床研究结果表明:肝积方能改善肝郁脾虚型肝癌患者的主要临床症状,减少临床症状积分;同时肝积方使外周血CD8⁺下降,CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺比值、CD3⁺/mHLADR⁺比值上升。经初步动物实验及临床研究表明,肝积方具有一定保肝抑瘤功效,能够改善肝癌患者的细胞免疫功能低下的状态,抑制肿瘤生长以及诱导肝癌细胞凋亡。