益气健脾法治疗抑郁症及保护血管内皮的研究目的:抑郁症是临床常见的精神疾病,已被列为心血管疾病的独立危险因素之一。常用的抗抑郁药能够引起心律失常、低血压等副反应。因此,开发一种安全有效的治疗抑郁症并保护心血管的药物迫在眉睫。中医药强调形神一体的观念,在疾病的治疗中积累了丰富的临床经验,具有重要的研究价值。本研究以逐层深入的科学思维为指导,从理论研究、临床研究和实验研究三个方面展开,通过古籍梳理,临床调查、荟萃分析、数据挖掘和德尔菲专家函询,初步明确“从虚论治”抑郁症的核心方剂——健脾通脉方的科学性和合理性。运用网络药理学预测健脾通脉方治疗抑郁症的作用靶点和潜在机制,并通过动物实验对健脾通脉方治疗抑郁症及保护血管内皮的作用进行验证。方法:1.理论研究:以浙江中医药大学图书馆馆藏结合《中华医典》为基础,以“郁”“郁证”“情志”“七情”和“悲”等为检索词,对先秦至明清时期中医古籍进行检索。通过中医文献学的研究方法,对“郁”理论的源流、演变和内涵进行整理和分析,从逻辑关系的角度进行理论推导,阐明抑郁症归属于中医郁证范畴存在的矛盾性。通过文献研究发现抑郁症归属中医情志病范畴具有合理性,且情志“悲”与抑郁症的核心情绪症状较为相关。通过对古籍中情志“悲”的治疗方药进行了整理,以频次统计和关联规则分析对古籍文献中治“悲”方剂的基本治法和用药特征进行研究。2.临床研究:2.1通过小样本临床调查收集抑郁症患者的症状资料,以机器学习进行无监督聚类分析,并将聚类结果与中医证型进行相关性探讨。2.2采用荟萃分析的方法,从中英文数据库中检索和收集随机对照试验（Randomized controlled trial,RCT）研究,根据纳入排除标准和质量评价,筛选符合标准的文献并进行数据提取,通过Revman5.3软件和Stata13.0软件合并效应量,对补虚方剂治疗抑郁症的临床疗效、汉密尔顿抑郁量表（Hamilton Depression Scale,HAM-D）评分、中医证候积分、不良反应和副反应量表（Treatment Emergent Symptom Scale,TESS）评分进行科学分析。2.3通过频数分析、关联规则和聚类分析对荟萃分析中纳入的补虚方剂进行中药数据挖掘。以补虚药的数据挖掘结果为基础,构建德尔菲专家函询表进行专家意见收集,结合专家意见和权重分析结果,在本课题组前期研究的基础上,明确健脾通脉方是“从虚论治”抑郁症的核心方剂之一。3.实验研究:3.1通过网络药理预测健脾通脉方治疗抑郁症的核心靶点及相关机制:使用数据库结合文献研究获取健脾通脉方治疗抑郁症的潜在靶点,通过String数据库构建蛋白-蛋白互作（Protein protein interaction,PPI）网络,通过CTD数据库进行基因本体论（Gene ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）富集分析。3.2通过慢性不可预测温和应激（Chronic unpredictable mild stress,CUMS）诱导小鼠抑郁样行为模型。（1）小鼠行为学测试验证健脾通脉方改善CUMS模型小鼠抑郁样行为的作用;通过ELISA测定小鼠海马组织和血清中神经递质（5-HT、NE）和炎症因子（TNFα、IL-1β、IL6）水平;通过Western blot检测海马组织中胶质细胞标志性蛋白（GFAP、Iba1）、炎症因子（TNFα、IL-1β）和突触可塑性蛋白（PSD95、Arc）的表达。（2）通过ELISA测定小鼠主动脉组织及血清中NO、血浆ET-1水平,主动脉组织炎症因子（TNFα、IL-1β、IL6）及氧化应激（SOD、MDA）水平;通过免疫组化检测小鼠胸主动脉组织中eNOS、VCAM-1、ICAM-1的表达;HE染色观察小鼠胸主动脉内皮细胞的病理形态改变;通过透射电观察小鼠胸主动脉内皮细胞超微结构的改变。结果:1.理论研究:通过对古籍文献中相关条文的整理和分析,发现“郁”的内涵经历了一个从意象到具象的演变过程。.无论是广义之郁还是狭义之郁,都无法在症状和逻辑上与抑郁症完全对应。基于抑郁症的核心情绪症状为抑郁心境,诊断特征为悲伤、空虚、沮丧的心境,与中医情志“悲”关系密切。因此,从情志“悲”的角度探讨改善抑郁症核心情绪症状的中医治疗具有合理性。基于古籍文献整理和归类分析,发现古籍中治“悲”的方剂主要可以分为“从虚论治”“从实论治”“从虚实夹杂论治”和“其他论治”等4个方面。其中,“从虚论治”是最主要的治疗类别,进一步分析发现“从虚论治”主要以补脾肺和补心和为主,注重从补益气血的角度改善“悲”的情绪症状;“从实论治”主要包括从风论治、从寒论治、从热论治、从痰论治和从瘀论治;虚实夹杂论治主要为荣卫失调、伤寒两感三焦气虚、肺脉外证（伤寒）、心气不定,五脏不足（风热）等。通过对古籍中治“悲”的方剂进行统计分析发现,补气类药和补阳类药的使用频率最高,其中,主要的补气药有人参、炙甘草、白术、黄芪等,主要的补阳中药为肉桂、附子、干姜、细辛等。关联规则分析结果发现补气药和化湿药与其他类别中药的关联性最高。2.临床研究:2.1应用机器学习探讨临床中抑郁症的中医证候分布:通过机器学习对抑郁症患者的临床症状进行聚类分析,发现其中的4个聚类结果与中医证型分类基本一致。其中,聚类1的情绪症状主要为暴躁易怒、抑郁、焦虑,躯体症状主要为咽喉部感觉有异物、胃胀反酸、口苦、便秘等,符合肝郁化火证;聚类2的情绪症状主要为焦虑、抑郁、紧张及胡思乱想,躯体症状主要为口干、不爱动、乏力、胸闷、叹气等,符合肝郁脾虚证;聚类3的的情绪症状主要为兴趣降低、抑郁、胆怯害怕及疑病,躯体症状主要为大便稀、食欲差、不爱动、头晕、乏力、气短等,符合脾气虚证;聚类4的情绪症状主要为抑郁、兴趣降低、自卑,躯体症状主要为记忆力减退、感觉精力不足、腰酸腿软、脱发、口干、头晕等,符合肾精亏虚,脑髓失养证。以上研究表明虚证在临床抑郁症患者中客观存在。2.2补虚法治疗抑郁症的荟萃分析研究:通过对37项补虚方剂治疗抑郁症的RCT试验进行荟萃分析发现,与对照组相比,补虚方剂治疗可以显著提升抑郁症的临床疗效（OR=2.03,95%CI[1.73,2.38]）,降低HAM-D评分（SMD=-0.97,95%CI[-1.32,-0.62]）和中医证候积分（SMD=-1.76,95%CI[-2.58,-0.94]）。同时,补虚方剂治疗组的TESS评分更低（SMD=-1.63,95%CI[-2.66,-0.60]）,不良反应发生更少（OR=0.28,95%CI[0.19,0.40]）。2.3.健脾通脉方是补虚法治疗抑郁症的核心方剂之一:通过对荟萃分析中的有效补虚方剂进行数据挖掘发现,高频的补虚中药主要包括黄芪、茯苓、甘草、大枣、当归、远志、白术和党参等。中药特征分析表明性温、味甘、入脾经的中药使用频率最高,前20味高频中药中补气类中药最多,这与健脾通脉方的用药特点较为一致。德尔菲专家函询结果发现补脾气的均分和满分频率最高,表明专家对补脾气治疗抑郁症较为认可,这与健脾通脉方的组方思路较为一致;专家问卷的变异系数和肯德尔协调系数均较低,表明专家意见的协调程度较高;权重分析结果表明专家认为补虚法治疗抑郁症的核心补虚中药为黄芪、党参、茯苓等,这与健脾通脉方的药物组成基本一致。以上结果表明健脾通脉方是治疗抑郁症的核心方剂之一。3.实验研究:3.1网络药理学预测健脾通脉方治疗抑郁症的主要核心靶点包括TNF、AKT1、IL6、TP53、IL1β、VEGFA、JUN、CASP3、MAPK3 和PTGS2。GO 分析主要指向化学突触传递（突触后）和G蛋白偶联胺受体活性等。KEGG通路主要涉及参与神经活性配体-受体相互作用、5-羟色胺能突触、TNF信号通路、PI3K-AKT信号通路等。3.2健脾通脉方改善CUMS诱导的小鼠抑郁样行为的研究。（1）在蔗糖偏好（Sucrose preference test,SPT）试验中,CUMS模型组小鼠的SPT水平明显低于空白对照组（p＜0.05）,健脾通脉方中、高剂量和氟西汀均可提升小鼠的SPT水平（p＜0.05）。在悬尾测试（Tail suspension test,TST）和强迫游泳测试（Forced swimming test,FST）中,CUMS模型组小鼠的不动时间较空白对照组显著升高（p＜0.05）,而健脾通脉方中、高剂量组和氟西汀组的小鼠不动时间较CUMS模型组小鼠显著降低（p＜0.05）;（2）与空白对照组相比,CUMS模型组小鼠海马组织中5-HT和NE水平均下降（p＜0.05）,而健脾通脉方中、高剂量组与CUMS模型组相比,小鼠海马组织中的5-HT和NE水平均显著升高（p＜0.05）;（3）与空白对照组相比,CUMS模型组小鼠的血清炎症因子水平（TNFα、IL1β、IL6）显著升高,而健脾通脉方高剂量组与CUMS模型组相比,小鼠血清中上述炎症因子水平均降低（p＜0.05）,海马组织中的炎症因子（TNFα、IL1β）也显示了相同的趋势。同时,比之空白对照组,CUMS模型组小鼠海马组织中GFAP和Iba1蛋白表达显著增加,而高剂量健脾通脉组与CUMS模型组相比GFAP和Iba1的蛋白表达水平均下降（p＜0.05）;（4）与空白对照组相比,CUMS模型组小鼠海马组织中PSD95和Arc的表达降低（p＜0.05）,健脾通脉方高剂量组与模型组相比,PSD95和Arc的表达显著上升（p＜0.05）。3.3健脾通脉方保护CUMS模型小鼠血管内皮的研究。（1）与空白对照组相比,CUMS造模8周后模型组小鼠血清和主动脉组织中NOx水平下降,血浆ET-1水平升高（p＜0.05）,与CUMS模型组相比,健脾通脉方高剂量组小鼠血清和主动脉组织中NOx水平上升,血浆的ET-1水平下降（p＜0.05）,同时,与空白对照组相比,CUMS模型组小鼠胸主动脉组织中eNOS的表达水平降低（p＜0.05）,健脾通脉方高剂量组与模型组相比eNOS的表达水平升高;（2）主动脉组织HE染色结果显示,CUMS模型组可见少量内皮细胞的脱落,但损伤性改变不明显,空白对照组和健脾通脉方高剂量组血管结构完整,各层清晰可见,血管内皮细胞完整覆盖;（3）透射电镜结果显示,CUMS模型组小鼠的血管内皮细胞出现了细胞肿胀,空白对照组和健脾通脉方高剂量组小鼠血管内皮细胞胞形态正常;（4）与空白对照组相比,CUMS模型组小鼠胸主动脉组织中的TNFα、IL1β和IL6的水平上升,健脾通脉方高剂量组与模型组相比上述炎症因子的水平均下降（p＜0.05）;（5）与空白对照组相比,CUMS模型组小鼠胸主动脉组织中VCAM-1和ICAM-1表达升高（p＜0.05）,健脾通脉方高剂量组与模型组相比VCAM-1和ICAM-1的表达下降;（6）与空白对照组相比,CUMS模型组小鼠胸主动脉组织中MDA含量明显升高（p＜0.05）,健脾通脉方高剂量组与模型组相比,MDA的含量显著下降（p＜0.05）,同时,胸主动脉组织SOD活力检测结果显示,与空白对照组相比,CUMS模型组小鼠的SOD活力明显下降（p＜0.05）,健脾通脉方高剂量组与模型组相比SOD活力显著上升（p＜0.05）。结论:1.抑郁症属于中医情志病范畴,从中医情志“悲”角度入手研究抑郁症核心情绪症状的中医治疗具有科学性和合理性。古籍文献中治“悲”的方剂主要可以分为“从虚论治”“从实论治”“从虚实夹杂论治”和“其他论治”等4个方面,其中,“从虚论治”的方剂占比最高,补虚法是治疗情志“悲”的主要治法之一,补气类中药是治“悲”的主要类别,也是最常用的配伍之一。本部分理论研究为补虚法治疗抑郁症提供了中医理论基础。2.临床调查发现虚证在真实世界的抑郁症患者中客观存在。荟萃分析结果表明补虚方剂能够提高抑郁症治疗的有效率、降低HAM-D评分和中医证候积分,并具有较好的安全性。荟萃分析证实的有效补虚方剂中,性温、味甘、入脾经的中药使用频率最高,前20味高频中药以补气类药物最多,这与健脾通脉方的用药特点基本一致。德尔菲专家函询结果表明专家对补脾气法治疗抑郁症较为认可,黄芪和党参被认为是有价值的抑郁症治疗药物,这与健脾通脉方的组方思路和药物组成基本一致。本部分临床研究为补虚法治疗抑郁症提供了临床依据,并发现健脾通脉方是补虚法治疗抑郁症的核心方剂之一。3.网络药理学研究表明健脾通脉方治疗抑郁症可能与改善神经递质水平和炎症反应相关。实验研究证实健脾通脉方能够改善CUMS模型小鼠的抑郁样行为,其效应机制与提高小鼠海马组织中的神经递质水平、抑制胶质细胞活化、降低炎症因子水平和改善突触可塑性相关。同时,健脾通脉方能够调节CUMS模型小鼠胸主动脉血管的舒缩功能,抑制血管内皮细胞活化,降低主动脉组织中的炎症因子水平和氧化应激反应,从而达到保护血管内皮的作用。本部分实验研究为补虚法治疗抑郁症的核心方剂——健脾通脉方提供了科学验证,并初步探讨了其对血管内皮的保护作用。