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导言:卵巢储备功能是指卵巢皮质区卵泡生长、发育、形成可受精卵母细胞的能力,包括卵泡的数量和卵子的质量。卵巢低储备(diminished ovarian reserve,DOR)患者表现为卵巢反应减退,获卵数降低,周期取消率增多。DOR可能是卵巢早衰和绝经的前兆,因此卵巢储备功能下降是目前辅助生殖中的重点和难点,其发病机制目前尚不明确。卵母细胞分泌的生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)在体外可模拟卵母细胞对颗粒细胞扩展的促进作用,诱导颗粒细胞扩展相关基因的表达,促进卵泡发育。GDF9的下游基因Gremlin1(GREM1)属于骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)拮抗剂家族,由卵巢颗粒细胞分泌,是GDF9和BMP信号通路交互作用的重要调节分子,在卵泡发育过程中发挥重要作用。旨在调查卵巢储备功能降低患者颗粒细胞GREM1表达水平变化,探究GREM1对颗粒细胞扩展相关基因表达的影响,特开展以下研究。方法:选取2018年8月-2019年3月在浙江大学医学院附属妇产科医院生殖医学治疗中心因单纯输卵管性不孕而行辅助生育治疗的患者,留取其卵泡穿刺液标本,年龄<38岁。根据2015年美国生殖医学会(American Society Of Reproductive Medicine,ASRM)发布的《卵巢储备功能的检测及评价方法》,符合以下两项或以上的患者被分类为DOR组:(1)月经第3天基础卵泡刺激素(basal follicle stimulating hormone,bFSH)≥ 11.4mIU/ml;(2)血清抗苗勒氏激素(anti Mulerian hormone,AMH)≤1.4 ng/ml;(3)窦卵泡数(antral follicle number,AFC)≤4。同时符合以下三条的患者被分类为卵巢储备功能正常(normal ovarian reserve,NOR)组:(1)FSH<10 mIU/m1;(2)AMH>2.0 ng/ml;(3)窦卵泡数(antral follicle number,AFC)>5。同时排除引起不孕症的其他疾病。分离和提取卵泡穿刺液中的卵巢颗粒细胞,用Western-blot和免疫荧光检测并分析NOR、DOR组颗粒细胞中GREM1的蛋白水平表达量;体外培养人原代颗粒细胞,设计针对GREM1基因的siRNA和过表达质粒,转染原代颗粒细胞,72小时后用Western-blot检测肿瘤坏死因子α诱导蛋白6(tumor necrosis factor alpha-induced protein,TNFAIP6)、穿透素 3(pentraxin 3,PTX3)、前列腺素合成酶2(prostaglandin synthase,PTGS2)和GREM1蛋白表达量;以浓度分别为0、0.05、0.5及1μg/mL的重组人Gremlin1蛋白加入含FSH的无血清培养基,培养原代卵巢颗粒细胞6h,提取总RNA,用RT-PCR检测颗粒细胞扩展相关基因的mRNA表达量,检测外源性GREM1蛋白对颗粒细胞扩展的影响。用SPSS进行统计学分析。结果:1.与NOR组相比,DOR组的卵巢颗粒细胞中GREM1的蛋白表达水平明显下调;2.GREM1 siRNA作用的颗粒细胞中PTX3、TNFAIP6和PTGS2的蛋白表达量显著低于阴性对照组;3.GREM1质粒作用的颗粒细胞中PTX3、TNFAIP6和PTGS2的蛋白表达量显著高于阴性对照组;4.在原代颗粒细胞培养基中加入重组人Gremlin1蛋白,可显著上调PTX3、TNFAIP6和PTGS2的mRNA表达水平,且诱导效应呈浓度依赖性。结论:1.卵巢颗粒细胞GREM1的蛋白表达量与卵巢储备功能相关;2.颗粒细胞GREM1的表达影响颗粒细胞扩展过程,正向和反向调节GREM1均可以影响颗粒细胞扩展相关基因(PTX3、TNFAIP6和PTGS2)的分子水平;3.外源性GREM1可以上调颗粒细胞扩展相关基因的表达,且有浓度依赖性;4.GREM1通过调节颗粒细胞扩展过程影响卵泡发育和卵巢储备功能。