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背景： 高尿酸血症是一种嘌呤代谢紊乱引起的代谢性疾病。近年随着我国人民生活水平的提高，高尿酸血症的患病率显著升高。研究表明，高水平尿酸和体内多种代谢紊乱如高血压、高血脂、高血糖等有关，同时可表现为痛风、炎症反应、内皮功能不全等。此外，高尿酸血症常与糖代谢异常尤其是胰岛素抵抗并存，参与糖尿病和心脑血管疾病的病理过程，最终诱发各种并发症，严重影响患者的生活质量。骨骼肌是体内糖摄取、糖利用、糖储存的最重要代谢器官之一，在胰岛素的刺激下，骨骼肌摄取人体葡萄糖总量的75％左右，是维持体内葡萄糖动态平衡的重要靶组织。有研究报道 ROS产生过多或抗氧化防御能力减弱时，细胞氧化应激状态可降低对胰岛素的敏感性，是胰岛素抵抗产生的重要原因。胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate-1，IRS1）、AKT（Protein kinase B，蛋白激酶B）、葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter4，GLUT4）是骨骼肌细胞胰岛素信号通路中三个关键信号蛋白，我们前期研究已经发现高尿酸在肝脏、心肌等细胞中通过氧化应激激活 IRS1及抑制 AKT进而抑制了胰岛素信号的传导。然而，高尿酸在骨骼肌细胞中诱导胰岛素抵抗的分子机制仍未被阐明。 二甲双胍，是临床最常用的双胍类降糖药物，有降糖、降脂、改善胰岛素抵抗的作用。AMPK（Adenosine5-monophosphate(AMP)-activated protein kinase）是细胞能量调节的感受器，参与细胞能量调节及传递。AMPK的活化可增加ATP合成代谢，促进脂肪酸氧化。有研究发现二甲双胍改善胰岛素抵抗的机制可能是激活 AMPK，调控葡萄糖相关酶（GLUT1GLUT4）的转运，参与相应的葡萄糖代谢以维持能量平衡。也有研究报道二甲双胍可通过经典胰岛素信号改善胰岛素抵抗。然而，二甲双胍是否可以改善高尿酸诱导的骨骼肌细胞胰岛素抵抗及其作用机制，目前仍不明确。 目的： 探讨高尿酸对骨骼肌C2C12细胞株的氧化损伤作用及其诱导胰岛素抵抗的分子机制；明确二甲双胍对高尿酸诱导的骨骼肌胰岛素抵抗的改善作用及其机制，为治疗高尿酸诱导的胰岛素抵抗提供新的理论基础。 方法： 1.用含10%胎牛血清的高糖 DMEM培养基培养小鼠成肌细胞株 C2C12细胞，增殖培养至细胞密度达90%-100%融合后更换含2%马血清的高糖DMEM培养基诱导分化7天，直至观察到细胞肌管的出现。实验过程中改用不含血清的培养基。 2.用不同浓度尿酸作用C2C12细胞不同时间，蛋白免疫印迹（Western Blot）方法检测尿酸刺激后C2C12细胞胰岛素信号通路蛋白AKT（s473）磷酸化水平，确定尿酸的最佳实验浓度及时间。 3.使用 DCFH-DA探针37℃下作用细胞30min，倒置荧光显微镜观察高尿酸对C2C12细胞氧化应激状态以及流式细胞仪检测活性氧水平变化。 4.使用胰岛素及荧光标记葡萄糖2-NBDG作用细胞20分钟，倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪检测高尿酸对骨骼肌细胞葡萄糖摄取的影响。 5.用不同浓度尿酸作用C2C12细胞24h，胰岛素作用10min，蛋白免疫印迹方法检测尿酸刺激后胰岛素信号分子IRS1（s307）和AKT磷酸化水平的影响。C2C12细胞用抗氧化剂 NAC预处理1h后，蛋白免疫印迹方法检测高尿酸组和对照组胰岛素信号分子IRS1和AKT磷酸化水平。 6.用不同浓度二甲双胍和高尿酸作用C2C12细胞24h，蛋白免疫印迹方法检测二甲双胍刺激后C2C12骨骼肌细胞胰岛素信号通路蛋白AMPK磷酸化水平、细胞膜上GLUT4表达量；同样分组细胞，用胰岛素作用10min，蛋白免疫印迹方法检测二甲双胍预处理后，对尿酸刺激胰岛素信号分子 AKT磷酸化水平及细胞膜上GLUT4表达量的影响。 7.二甲双胍和高尿酸作用 C2C12细胞24h，分别用50uM PI3K/AKT抑制剂LY294002和10uM AMPK抑制剂Compound C预处理1h，胰岛素及荧光标记葡萄糖2-NBDG作用细胞20分钟，流式细胞仪检测二甲双胍对高尿酸抑制骨骼肌细胞葡萄糖摄取的影响。 结果： 1.高尿酸显著抑制骨骼肌C2C12细胞胰岛素刺激的葡萄糖摄取，诱导胰岛素抵抗。高尿酸（15mg/dl）显著增加骨骼肌 C2C12细胞内活性氧水平，抗氧化剂 NAC阻滞由高尿酸诱导的氧化应激。 2.高尿酸（15mg/dl）增加胰岛素信号通路IRS1(s307)磷酸化，抑制AKT（s473）磷酸化。抗氧化剂NAC能阻滞高尿酸诱导的骨骼肌细胞胰岛素信号通路受损。 3.二甲双胍促进细胞葡萄糖摄取，改善高尿酸诱导的骨骼肌细胞胰岛素抵抗。 4.二甲双胍浓度依赖性地激活 AMPK、恢复高尿酸抑制的 GLUT4的细胞膜转位、解除高尿酸对AKT磷酸化的抑制作用。 5. AMPK和PI3K/AKT抑制剂可部分消除二甲双胍对高尿酸诱导的骨骼肌细胞糖摄取障碍的改善效果。 结论： 高尿酸增加骨骼肌C2C12细胞ROS水平、抑制IRS1-AKT信号途径和胰岛素刺激的葡萄糖摄取，诱导胰岛素抵抗，氧化应激在高尿酸诱导胰岛素抵抗产生中起关键作用。二甲双胍促进细胞葡萄糖摄取，改善高尿酸诱导的骨骼肌细胞胰岛素抵抗。AMPK-GLUT4和AKT-GLUT4信号参与了二甲双胍对高尿酸诱导的骨骼肌细胞胰岛素抵抗的改善作用。