论文部分内容阅读
产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）,旧称魏氏梭菌（C.welchii）或产气荚膜杆菌（Bacillus perfringens）,是一种革兰氏阳性菌,两端钝圆,单个或成双排列。该菌的致病因子是其产生的外毒素,目前已发现其可产生超过20种外毒素。根据其产生的主要6种外毒素（α、β、ε、ι、CPE、Net B）,可将其分为A～G七种型。其中α毒素（alpha toxin,CPA）可由所有型别产气荚膜梭菌产生,主要导致的疾病为绵羊黄羊病和食物中毒、气性坏疽。其中,CPA所致的气性坏疽具有发病急、进展快、缺乏特效药、预后差、死亡率高的特点,给人们的生产生活造成很大影响。同时,CPA作为重要的生物毒素战剂和生物恐怖剂已被我国和国际社会列入生物两用品进出口管制清单。因此,推进CPA的研究在保障我国乃至世界各国的生物安全方面有重要应用价值。目前关于CPA的研究局限于其作为磷脂酶的作用,一般认为CPA导致的溶血主要是因为其水解细胞膜,导致红细胞破裂引起溶血。关于CPA与红细胞结合后导致溶血的分子机制尚缺乏进一步研究。因此,本研究以人和小鼠红细胞为模型,旨在揭示CPA溶血的分子机制,最终为CPA所致疾病的临床治疗提供理论基础。首先,通过本实验室保存的p TIG-his-cpa（C端含6×His标签）质粒表达重组毒素蛋白r CPA,并使用镍离子亲和层析柱对其纯化。纯化后的r CPA超滤浓缩后,通过SDS-PAGE和免疫印迹实验鉴定其纯度和性质,最终通过BCA法测定蛋白浓度,保存于4℃备用。接着,以人红细胞和小鼠红细胞为实验对象,检测r CPA溶血能力,并探究不同毒素浓度、反应时间、反应温度对r CPA溶血的影响。结果发现,r CPA与人红细胞在37℃孵育48 h,最大可导致80%的红细胞溶血,对小鼠红细胞则在90%左右。此外,温度对r CPA导致的溶血具有重要影响,在25℃及4℃均产生了明显的溶血抑制现象,而在42℃孵育时,r CPA溶血能力与37℃无区别。其次,通过扫描电子显微镜对人红细胞进行形态观察,发现r CPA作用于人红细胞后,红细胞形态发生明显的改变,主要体现为红细胞体积皱缩,红细胞表面在出现大量凹陷和突起后,发生溶解。以上述研究为基础,进一步探索r CPA溶血的分子机制。近年许多研究表明,一些成孔毒素诱导的红细胞溶血与P2受体的激活密切相关,例如产气荚膜梭菌ε毒素、金黄色葡萄球菌α毒素、大肠杆菌α溶血素等。但是目前尚缺乏非成孔毒素导致溶血与P2受体相关关系的研究。将非选择性ATP受体（P2受体）抑制剂（PPADS）作用于r CPA溶血体系时,r CPA对人和小鼠红细胞的溶血能力均可以被PPADS抑制,并随着PPADS浓度的升高,其抑制能力逐渐增强。这一现象证明P2受体与r CPA诱导的溶血密切相关。因此,本研究进一步使用多种P2受体选择性抑制剂探究其对r CPA溶血能力的影响。抑制剂的结果表明,r CPA诱导的溶血,在人红细胞中起关键作用的P2受体亚型为P2X7和P2Y13;在小鼠红细胞中起关键作用的亚型为P2X1和P2Y13。也有报道指出,ATP参与到某些成孔毒素的溶血过程,ATP从毒素形成的孔道释放后,会激活P2受体,P2受体与pannexin1通道相互作用,形成P2-pannexin1复合物,放大ATP的释放并进一步促进溶血。因此,胞外ATP在r CPA溶血中的作用需进一步探究。通过对胞外ATP含量检测发现,在r CPA溶血前期存在ATP的大量释放,并在5min达到最大值。当使用ATP降解酶三磷酸腺苷双磷酸酶（Apyrase）降解胞外ATP时,发现其对r CPA的溶血能力并未产生影响。当进一步使用pannexin1通道蛋白抑制剂甘珀酸（Carbenoxolone）和甲氟喹（Mefloquine）抑制pannexin1通道蛋白的激活时,发现其对r CPA诱导的溶血也无作用。因此,P2受体的激活与胞外ATP和P2-pannexin1复合体的形成无关。为探究P2受体激活后可能影响到的下游通路,本研究使用非靶向代谢组学分析方法,测定r CPA作用于人红细胞后代谢物的变化。结果发现r CPA作用于人红细胞后受到影响的主要代谢通路为丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路。经过文献调研,该通路与细胞内活性氧的产生密切相关。而红细胞内缺乏线粒体,它的活性氧主要由NADPH氧化酶产生,因此,使用NADPH氧化酶抑制剂二苯基氯化碘盐（Diphenyleneiodonium chloride,DPI）进行验证,最终证实NADPH氧化酶在r CPA诱导的溶血中发挥关键作用。最后,本研究以NADPH氧化酶的激活通路以及DPI的作用机制为依据,使用多种抑制剂验证,最终初步揭示P2受体激活后通过MEK1/ERK1以及PI3K/Akt途径激活NADPH氧化酶,导致活性氧产生并诱导溶血的通路。本实验室前期的工作证实了成孔毒素ETX只会引起人红细胞的溶血,且ETX诱导的溶血与人红细胞的P2X7和P2Y13受体有密切关系。因此,我们推测,在成孔毒素与非成孔毒素之间,可能存在一条基于P2受体的共同的溶血通路。为了验证这一猜想,首先构建带荧光标签的产气荚膜梭菌ε毒素（ETX）,进一步验证早期ETX溶血的研究;同时通过构建金黄色葡萄球菌b溶血素（Hlb）,证明了P2受体在非成孔溶血毒素导致的溶血中的作用存在普遍性。综上,本研究发现了P2受体抑制剂对r CPA溶血的抑制效果,明确了影响r CPA溶血的关键因子为P2受体,初步揭示r CPA激活P2受体、促进活性氧产生并最终导致溶血的信号通路。这些发现改变了传统观念上对r CPA溶血机制的认知,证明在成孔毒素与非成孔毒素导致的溶血之间可能存在一条基于P2受体的、通用的溶血通路,为CPA所导致疾病的治疗提供新的思路。