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目的本研究旨在探索骨髓间充质干细胞源外泌体（Bone marrow Mesenchymal Stem Cells-derived Exosomes,BMSC-Exos）通过雾化吸入对脂多糖（LPS）及香烟诱导的慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）大鼠上皮-间质转化（Epithelial Mesenchymal Transition,EMT）过程的抑制作用,并探讨其作用机制。方法1.骨髓间充质干细胞的分离、鉴定及外泌体的提取采用全骨髓贴壁法培养大鼠BMSCs,并用流式细胞术进行检测。应用外泌体浓缩试剂盒及纯化试剂盒分离纯化第三代BMSCs来源的外泌体,并通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）、纳米粒子跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）和蛋白质免疫印迹法（Western Blotting）对其进行鉴定。2.COPD大鼠模型的建立应用脂多糖联合熏烟方法建立COPD大鼠模型。实验第1天和第14天,除对照组外每只大鼠气管内注入LPS各200μg/200μl。第2~13、15~28天每日上、下午置于烟熏箱内被动吸烟（焦油25 mg;CO 13 mg;尼古丁1.1 mg）处理,每次0.5h,2次烟熏间隔时间大于或等于6h。对照组大鼠气管内注射等量生理盐水。3.实验分组42只4周龄SD大鼠随机分为7组,每组6只。对照组（Control）:气管内滴注和雾化等量的PBS;模型组（Model）:LPS滴注联合熏烟造模,雾化等量的PBS;低剂量BMSC-Exos雾化组（Low-MSC-Exos（IN））:造模大鼠,雾化吸入0.5×108 particles/kg的BMSC-Exos悬液1ml;中剂量BMSC-Exos雾化组（Mid-MSC-Exos（IN））:造模大鼠,雾化吸入1.0×108 particles/kg的BMSC-Exos悬液1ml;高剂量BMSC-Exos雾化组（High-MSC-Exos（IN））:造模大鼠,雾化吸入1.5×108particles/kg的BMSC-Exos悬液1ml;BMSC-Exos尾静脉注射组（MSC-Exos（IV））:造模大鼠,尾静脉注射1.5×108particles/kg的BMSC-Exos悬液1ml;激素雾化组（Hormone（IN））:造模大鼠,雾化吸入1ml普米克令舒（1mg/只）。各治疗组连续治疗5天,每次30min。4.雾化BMSC-Exos对COPD大鼠肺组织全身和局部炎症损伤及EMT相关机制的影响在大鼠干预治疗后的第28天,进行肺功能检测,解剖大鼠,收集肺组织样本、血清及BALF。比较各组肺功能情况并且验证COPD模型建立是否成功。采用ELISA检测各组支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）及血清中促纤维化因子β1（TGF-β1）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。使用苏木精和伊红（HE）以及马松染色来评估肺组织的变化。Western blotting检测EMT过程相关标志物的表达,包括E-钙黏蛋白（E-cadherin,E-cad）、细胞角蛋白19（Cytokeratin-19,CK19）和α-平滑肌动蛋白（α-Smooth muscle actin,α-SMA）,免疫组织化学染色（IHS）检测Wnt/β-catenin信号通路的标志物的表达,包括p-GSK-3β、GSK-3β、β-catenin和cyclin D1。结果1.BMSCs及其BMSC-Exos的分离和鉴定大鼠BMSCs培养至第3代时呈形状均一的长梭形,成聚集性生长;流式细胞术结果显示第3代BMSCs高表达CD73、CD90和CD105标志物,低表达CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR标志物;应用分子排阻色谱（SEC）纯化与亲和色谱浓缩相结合的原理分离纯化得到外泌体,TEM观察到提取的外泌体为类椭圆形的囊泡结构,呈典型的杯口状;NTA结果提示BMSC-Exos的峰直径为91.7nm,占比为97.3%,颗粒浓度为3.3×106/ml;Western blotting结果显示外泌体表面蛋白CD9和CD63呈高表达状态。2.各组大鼠肺功能情况与对照组相比,模型组肺功能出现严重损伤,但BMSC-Exos雾化治疗后显著改善了COPD大鼠的肺功能。与模型组相比,雾化BMSC-Exos治疗后,COPD大鼠0.2秒用力呼气容积（FEV0.2）、0.3秒用力呼气容积（FEV0.3）、0.2秒用力呼气容积/用力肺活量（FEV0.2/FVC）、0.3秒用力呼气容积/用力肺活量（FEV0.3/FVC）、呼出25%FVC时呼气流速（FEF25%）和呼出50%FVC时呼气流速（FEF50%）均显著性增加（P<0.05）。3.各组大鼠血清及BALF中TNF-α、IL-6和TGF-β1的水平雾化形式的BMSC-Exos可减轻COPD炎症反应及纤维化进程,其中以低剂量雾化作用最为显著。与模型组相比,BMSC-Exos雾化组、BMSC-Exos尾静脉组及激素组大鼠血清和BALF中TNF-α、IL-6及TGF-β1含量均降低（P<0.05）。其中低剂量BMSC-Exos雾化组的炎症因子及纤维化因子水平较其他治疗组降低的更为显著（P<0.05）。4.各组大鼠肺组织病理学变化在使用BMSC-Exos治疗后显著减少了COPD气道炎症和肺泡结构的破坏。但尾静脉注射BMSC-Exos及雾化激素的治疗效果并不显著。HE染色和masson染色结果显示,对照组大鼠肺泡结构正常,未见明显的炎症细胞的浸润,气管下胶原沉积较少。而模型组大鼠肺泡结构损伤,血管及支气管周围出现大量炎性细胞浸润,蓝色的胶原纤维阳性区域较多。然而经BMSC-Exos雾化治疗后,肺泡融合及炎性细胞浸润减少,蓝色的胶原纤维面积较小,且炎症评分显著降低（P<0.05）。5.不同治疗组EMT相关蛋白水平的表达LPS联合香烟烟雾诱导的COPD,促进了气道上皮细胞的EMT过程,而雾化形式的低、中剂量BMSC-Exos抑制了这一过程。Western blotting结果显示,与对照组相比,模型组上皮细胞标志蛋白CK19和E-cad的表达水平显著减少,间质细胞标志蛋白α-SMA表达水平显著增加（P<0.05）。在低剂量和中剂量BMSC-Exos及激素雾化治疗后,CK19和E-cad表达增加,α-SMA表达减少（P<0.05）。而高剂量BMSC-Exos雾化组和尾静脉组α-SMA的表达水平显著高于模型组（P<0.05）。6.不同治疗组Wnt/β-Catenin信号通路相关蛋白的表达水平BMSC-Exos雾化治疗后Wnt/β-catenin信号通路呈现负调控基因的高表达及下游基因的低表达。免疫组织化学结果显示,与对照组相比,模型组中Wnt/β-Catenin信号通路的下游基因Cyclin D1、β-catenin和P-GSK-3β表达增加,负调控基因GSK-3β表达减少。在低剂量BMSC-Exos雾化后,Cyclin D1、β-catenin和P-GSK-3β的表达减少,GSK-3β的表达增加。而在高剂量BMSC-Exos雾化组、尾静脉组、激素组中β-catenin和P-GSK-3β的表达与模型组相比无明显统计学差异（P<0.05）。结论1.雾化BMSC-Exos可以改善COPD模型大鼠的肺功能、炎症及纤维化损伤,减少上皮细胞转化,抑制EMT过程。2.在COPD模型大鼠中与EMT密切相关的Wnt/β-catenin信号通路异常活化,而雾化BMSC-Exos后衰减了这一信号,这可能是其抑制EMT过程的机制之一。