背景 肝移植是本世纪治疗终末期肝病的最重要的进展。肝脏移植历经30余年的努力，虽然已取得斐然的成绩，如首次肝移植的手术成功率超过90％、5年生存率达75～80％，再次移植的1年存活率达73％；但在进入90年代以后，全世界肝移植以每年5000～8000例的数量递增，供肝来源匮乏与等待供肝人数的矛盾日显突出。在美国及西欧等一些国家，供肝除少数来自亲属外，绝大部分来自脑死亡供体，供肝不存在热缺血问题，因此有关供肝热缺血损伤的研究长期未得到重视。然而在我国，所采用的供肝几乎均来自无心跳供者(NHBD)，供肝不可避免地经历一段热缺血再灌注损伤(I／R injury)，且在冷保存及肝复流过程中会进一步遭受损伤。除经济及技术等因素外，供肝质量不好被认为是制约我国肝移植长期疗效的重要因素。近年来，细胞凋亡与I／R损伤的关系的研究结果表明：I／R损伤时细胞凋亡现象是一个不断发生的动态过程，与缺血时间、程度和再灌注的情况有关；I／R早期即可出现细胞凋亡，发生时限先于细胞坏死。而目前由于取肝技术及供肝保存技术的发展，可能使I／R损伤后细胞凋亡成为移植肝术后肝功能不全的主要因素。因此深入研究I／R损伤后细胞凋亡机制及预防由I／R引起的细胞凋亡具有极其重要的临床意义。在各种因素启动的细胞凋亡过程中，线粒体是重要的执行者，而抗细胞凋亡剂多是线粒体膜稳定剂。还原型辅酶NADH参与细胞线粒体能量生成和细胞代谢，在三磷酸腺苷产生过程发挥关键作用。NADH参与损伤细胞的修复，它是自然界强效生物抗氧化剂，能够拮抗自由基引起的细胞 第四军医大学博士学位论文损伤。目的 本研究通过建立体外人正常肝细胞系L02和体内大鼠肝脏k损伤模型，观察体外I／R诱导细胞凋亡损伤，辅酶NADH抗凋亡线粒体调控机制和辅酶NADH体内桔抗k引起的肝脏损害，旨在阐明辅酶NADH在k诱导凋亡损伤中细胞保护的分子机制。为发展新型了R损伤细胞保护剂，开辟辅酶NADH应用新领域，提供新的策略。方法1．采用MTT比色法检测不同时间W对人L02肝细胞的细胞毒性作用， NADH对细胞增殖活性的影响，NADH预防和桔抗I／R对L02细胞的毒 性作用；流式细胞仪检测观察细胞凋亡率：IUNE L染色荧光显微镜及普 通显微镜观察细胞凋亡改变；透射电镜观察NADH桔抗I／R诱导肝细胞 凋亡的超微结构变化，了解辅酶NADH对k介导凋亡的桔抗作用。2．采用激光扫描共聚焦显微镜通过荧光探针R123检测线粒体跨膜电位A W m，探针 FluS．AM测定胞浆游离 CaZ”检测，探针 SNARFl．AM检测 细胞胞浆pH值和荧光探针H。DCF测定胞浆ROS水平变化；通过比色 法测定＊呷一3活性和C—p朋8活性改变：＊＊P＊R检测＊一、P53。 Bcl－2和 p－actin基因 tnRNA表达；Western blot检坝 Cyto C和P栅蛋 白表达变化；研究M诱导L02细胞凋亡损伤和辅酶NADH细胞保护干 预，阐明辅酶NADH细胞保护的线粒体调控机制。3．健康SD大鼠随机分3组，k处理组、NADH＋k处理组和对照组，检 测大鼠肝功能：透射电镜检测肝脏细胞超微结构改变；肝脏线粒体氧化 磷酸化功能检测计算状态3氧耗率O3）状态4氧耗率OJ，呼吸控制比 田CR）和磷／氧比（ADP0）；紫外分光光度计测定组织细胞胞浆NADH浓 度；进行肝组织DNA－Ladder电泳观察k后肝组织细胞的凋亡情况； Westenblot检测肝组织 BclZ、Bax、P53、Fas及 FasL蛋白表达的变化； 4 第四军医大学博土学位论文 观察辅酶NADH体内桔抗I／R引起的肝脏损害，以及阐明NADH其可能 机制。结果1．体外k引起肝细胞系L02凋亡损伤和辅酶NADH抗凋亡作用1＊不同时间k和辅酶NADH对肝细胞生长的影响 I／R诱导的正常人肝L02细胞变圆，贴壁能力逐渐消失，细胞体积变小， 细胞核浓缩，生长抑制，I／R培养 6h即开始出现生长抑制，至 12h细 胞抑制率达高峰为35．8上2．4％，18h及24h组细胞抑制率与12h组比较 无显著差异，说明k对肝细胞的损伤，早期随着I／R培养时间延长， g对肝细胞杀伤抑制作用增强；但具有时限性。100 v g／ml至 600 p g／nl浓度 NADH处理的细胞生长未受抑制，同一时间段内，各浓度 NADH组与对照组比较，细胞生长率无显著差异，说明 100v g／il至 600 V g／m浓度NADH对肝细胞生长无明显影响。1．2辅酶NADH对抗h的细胞损伤作用 N皿H＋k组生长率显著高于I／R组（＜0．05），第6h、12h、24h和48h 生长率由75土％％、52士3％、56土5％和53土2％上升到93士7％、128士5％、 137土6％和133O士9％，而WNADH组生长率与p组比较无显著性差 异，提示NADH可预防k对肝细胞的损伤作用。1．3辅酶NADH桔抗W介导的凋亡损伤 k组第6h至第24h凋亡率分别为门．5士2．20、35．6士3．1o、39．7士2．lo 和37．2士2．4％，而NADH＋k组凋亡率则为5．3 i04％、9石8