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脑卒中严重威胁着人类的健康,是全球范围内导致人类死亡的第二大危险因素。脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)患者中近75%的幸存者1 a后不能独立生活。针对脑出血现有的临床治疗手段主要是对症支持治疗(如降低血压、颅内压力或外科手术治疗等),治疗效果非常有限。炎症反应在脑出血引起的继发性脑损伤中起重要作用,但临床上尚缺乏相关的免疫调节方法。研究显示神经干细胞(neural stem cell,NSCs)移植可减轻炎症反应、减少神经元的死亡、减轻瘢痕形成和促进脑白质的功能再塑。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)来源的NSCs不涉及伦理和免疫排斥等问题,来源广泛并且充足。有研究表明T淋巴细胞亚群在脑出血后的免疫损伤中起重要作用。也有研究发现调节性T细胞(CD4~+CD25~+FOXP3~+regulatory T cell,Treg细胞)是一种重要的CD4~+T细胞,在ICH后可在脑内聚集,调节机体的免疫炎症反应。在本次研究中,我们通过将大鼠iPSC-NSCs经脑立体定位仪移植入胶原酶诱导的ICH模型大鼠脑内,从而探讨i PSC-NSCs移植对ICH大鼠脑内的T淋巴细胞亚群的比例及相应的细胞因子水平的调节能力。目的:通过观察大鼠iPSC-NSCs移植对ICH模型大鼠脑内的的T淋巴细胞亚群的比例及相应的细胞因子水平的影响,来探讨i PSC-NSCs移植减轻ICH模型大鼠神经功能障碍的免疫调节机理。方法:1.iPSC-NSCs的培养及鉴定:iPSC-NSCs用NSC培养基培养。经过培养后形成神经球样细胞结构,然后进行免疫荧光染色鉴定。2.将大鼠iPSC-NSCs经脑立体定位仪移植入ICH大鼠脑内:选取清洁级雄性SD大鼠120只,采用随机数字表法将大鼠分为三组,假手术组40只(采用大鼠脑立体定位仪仅仅定位穿刺,不注射Ⅶ型胶原酶和PBS溶液)、对照组40只(采用大鼠脑立体定位仪定位穿刺右侧纹状体并注射Ⅶ型胶原酶,ICH后4-6 h在鉴定造模成功后注射10 ul PBS溶液)、实验组40只(采用大鼠脑立体定位仪定位穿刺右侧纹状体并注射等量Ⅶ型胶原酶,ICH后4-6 h在鉴定造模成功后,经脑立体定位注射等体积含2×10~6个iPSC-NSCs的PBS溶液)。造模成功后用CM-Dil标记需要移植的大鼠iPSC-NSCs,在ICH大鼠造模后4-6 h苏醒后经脑立体定位仪移植入ICH大鼠脑内。3.在ICH大鼠造模后第3天用4%多聚甲醛灌注取出大鼠脑组织,观察血肿形成情况及移植的大鼠i PSC-NSCs在脑内的存活情况,然后采用免疫荧光染色计数ICH大鼠脑内的T淋巴细胞亚群的比例。造模后第3天分别提取各组大鼠新鲜的脑组织用于流式细胞术,测定大鼠脑内的T淋巴细胞亚群CD4~+T细胞、Treg细胞及γδT细胞的比例。分别取ICH造模后第1、3、7天各组大鼠新鲜的脑血肿周围组织通过ELISA法检测炎症相关细胞因子IL-6、IL-10、IL-17A及TGF-β1的浓度。结果:1.大鼠iPSC-NSCs经过NSC培养基悬浮/贴壁培养7-14天形成神经球样细胞团形成表达Nestin,SOX2阳性的神经球样细胞。i PSC-NSCs移植后成功地存活于ICH大鼠脑血肿周围并在大鼠脑内分化。2.与对照组相比,实验组大鼠神经功能恢复,mNSS评分从第14天起至28天均低于对照组(P<0.05)。3.在造模后第3天,免疫荧光染色计数分析结果显示实验组大鼠脑组织中CD3~+T细胞、CD4~+T细胞染色面积百分比均低于对照组(P<0.05)。4.在造模后第3天,流式细胞术检测结果显示实验组CD4~+T细胞和γδT细胞比例低于对照组,实验组Treg细胞比例高于对照组(P<0.05)。5.分别在造模后第1、3、7天,用ELISA法检测大鼠脑血肿周围组织中炎症相关细胞因子水平显示实验组和假手术组IL-6及IL-17A的浓度均低于对照组;实验组IL-10及TGF-β1的浓度均高于对照组(P<0.05)。结论:iPSC-NSCs移植可以调节ICH大鼠脑内的T淋巴细胞亚群的比例及相应的细胞因子水平,从而改善ICH大鼠神经功能。