前言慢性阻塞性肺疾病（简称:慢阻肺）是严重危害人类健康的常见病和多发病。多年来,尽管对于慢阻肺的临床及其基础研究给予了高度关注和极大投入,但结果却远不尽人意。迄今,慢阻肺的防控效果并不理想,原因涉及诸多方面,其中慢阻肺是具有很强异质性的疾病,其精确诊断方法的不到位以及发病机制并不十分明了,不能对其进行具有针对性、精准的个体化治疗和防控是重要原因之一。GOLD-2021（慢性阻塞性肺疾病全球倡议）将慢阻肺定义为:“慢阻肺是一种常见的,以持续的呼吸道症状和气流受限为特征的可预防和可治疗的疾病,通常是由明显暴露于有毒颗粒或气体引起的气道和/或肺泡异常所导致”。GOLD自2001年首次发布以来,经历了每年的更新和多次较大的修订。然而,对于慢阻肺“以持续的呼吸道症状和气流受限”是其特征的表述基本没有改变。肺功能是诊断慢阻肺的必备条件,即以吸入支气管舒张剂后FEV1/FVC＜70%作为评估存在气流受限的标准。由慢阻肺的定义可见,其气流受限的主要病理生理学改变的病理解剖基础是“气道和/或肺泡异常”。慢阻肺反复的气道炎症-修复-重塑和肺实质破坏-肺气肿形成的病理解剖改变共同导致了以FEV1减低和FEV1/FVC下降为标志的气流受限,仅由此慢阻肺的异质性即可见一斑。固然FEV1/FVC降低可以判断是否存在气流受限,但在鉴别不同病理解剖改变等深层次原因时,单一的FEV1/FVC很难获得更多的信息。其次,肺气肿是一个病理诊断,单纯的通气功能指标并不能反映其实际的病理变化。本研究从慢阻肺“气流受限”的病理生理改变出发,一方面,用宏观的、无创的、重复性好的脉冲振荡（Impulse oscillometry,IOS）技术对气流受限异质性进行探讨,试图为慢阻肺的临床精确诊断提供一些帮助;另一方面,在微观世界中对骨形态发生蛋白7（BMP7）在慢阻肺气道病变中的作用进行研究。分为上篇和下篇。上篇脉冲振荡对慢阻肺气流受限异质性评估价值的研究研究背景在慢阻肺的异质性研究中,气流受限的异质性一直备受关注。气流受限是慢阻肺诊断和评估中的核心问题,其发生的病理基础是气道病变-结构重塑-气道狭窄和肺组织破坏-肺气肿形成。不同慢阻肺个体中气道病变和肺气肿所占权重差异很大,此为慢阻肺疾病异质性的重要组成部分。在真实世界中,以气道病变为主或以肺气肿为主的慢阻肺患者具有不同的临床特点。研究显示以肺气肿为主（以下称气肿优势型）患者的肺功能下降速度更快,BMI下降和身体成分流失速度更快,急性加重次数更多。慢阻肺气流受限异质性的评估不仅有助于加深对疾病的理解,预测疾病发展,更有助于开展个体化治疗,提高慢阻肺治疗的有效性。譬如,以气道病变为主的慢阻肺患者对ICS的反应良好,而以肺气肿病变为主的患者,常常以肺康复治疗等非药物治疗获益更多。目前,临床广泛应用的气流受限评估指标FEV1/FVC、FEV1%只能评估气流受限的严重程度,而不能评价气流受限的异质性,即不能区分肺气肿和气道重塑在气流受限中的权重。尽管胸部定量CT是目前应用较多的气流受限异质性评估方法,但由于其需要专业软件,检测流程复杂,且花费较高,加之存在辐射风险,限制了其临床广泛应用。此外,虽然胸部CT在肺部结构病变评估方面具有优势,但不能全面反映患者的呼吸生理改变。因此,探索无创的、重复性良好、没有附加医疗污染的气流受限异质性评估的有效方法具有重要临床意义。脉冲振荡技术（impulse oscillometry,IOS）是一种能够简捷、无创的检测呼吸系统不同部位、不同时相的各种呼吸阻力分布特点的检查方法,具有操作简捷、费用低、重复性好、对患者配合要求低等优点。脉冲振荡技术对阻力的测定有较好的特异性,能够区分阻塞发生的部位、严重程度和呼吸动力学特征,因此能够对气流受限的形成原因进行更为深入的解读。如果同时测定吸-呼双相IOS指标,根据这些指标可能判断慢阻肺呼吸周期中各种阻力的来源、变化以及不同个体和疾病状态的差异,从而有助于气流受限异质性的评估。本研究拟探讨脉冲振荡对慢阻肺气流受限异质性评估的价值。材料方法本研究为病例对照研究。入组者行病史采集、脉冲振荡（IOS）检查、肺通气功能检查和吸气相胸部CT检查。1.研究对象:2017年7月到2019年11月间就诊于山东大学齐鲁医院的人群,年龄40-85岁。（1）慢阻肺组:入组标准为符合GOLD 2016诊断标准的稳定期慢阻肺患者。排除6周内发生急性加重及合并其他严重呼吸系统疾病者。（2）正常对照组:入组标准为无吸烟史、无呼吸系统症状和慢性呼吸系统疾病、肺通气功能正常的健康人群。排除合并其他系统严重疾病者。2.肺功能检查（1）肺通气功能指标:FEV1、FEV1%、FVC、FVC%、FEV1/FVC;（2）脉冲震荡指标:①吸-呼双相平均阻抗指标:Z5:呼吸总阻抗;R5:代表气道总阻力;R20:代表中心气道阻力;R5-R20:代表外周气道阻力;X5:代表胸肺周边弹性阻力;Fres:共振频率。②吸-呼双相IOS阻抗差值指标（呼气相阻抗指标减去吸气相阻抗指标）:ΔR5;ΔR20;ΔR5-R20;ΔX5;ΔFres。3.胸部定量CT检查:运用AirwayInspector软件计算肺气肿指标%LAA-950。4.对比慢阻肺患者和对照组的IOS指标（包括吸-呼双相平均IOS阻抗指标和吸-呼双相IOS阻抗差值指标）;分析IOS指标与定量CT肺气肿指标的相关性;根据肺气肿指数%LAA-950是否≥10%将慢阻肺患者分为:气肿优势型和非气肿优势型,运用ROC曲线探讨IOS指标在气肿优势型慢阻肺诊断中的价值。结果1.共纳入慢阻肺患者181例和正常对照者106例,两组受试者的年龄、性别比例和BMI无显著差异（P值均大于0.05）。2.慢阻肺组和对照组的脉冲振荡指标对比:慢阻肺组各项吸-呼双相平均IOS阻抗指标（R5,R20,R5-R20,X5,Fres）与对照组相比均存在显著差异（P值均小于0.05）。在吸-呼双相IOS阻抗差值指标方面,慢阻肺组和对照组的ΔR20无显著差异（0.11±0.34 VS 0.078±0.46 cmH2O/L/s,P=0.537）,而两组的 ΔR5、ΔR5-R20、ΔX5和ΔFres均存在显著差异（P值均小于0.05）。3.气肿优势组和非气肿优势组慢阻肺患者脉冲振荡指标对比:在吸-呼双相平均IOS阻抗指标中,气肿优势组与非气肿优势组只有X5存在显著性差异（-3.33±1.86 VS-2.49±1.23 cmH2O/L/s,P=0.001）,而两组的 R5、R20、R5-R20 和 Fres均无显著差异（P值均大于0.05）。在吸-呼双相IOS阻抗差值指标中,两组的ΔX5（-3.55±2.82 VS-1.61±2.78 cmH2O/L/s,P＜0.001）和 ΔFres（4.97±5.70 VS 3.03±5.06Hz,P=0.0162）均存在显著差异,而 ΔR5、ΔR20、ΔR5-R20 无显著差异（P值均大于0.05）。4.脉冲振荡指标与肺气肿指数的相关性:相关性分析显示,%LAA-950与ΔX5（r=0.545,P＜0.001）、X5（r=-0.229,P=0.002）和 ΔFres（r=0.200,P=0.009）均显著相关,其中ΔX5相关性最好。5.ΔX5、X5和ΔFres对气肿优势型慢阻肺患者诊断价值的ROC曲线分析:ΔX5判断气肿优势型慢阻肺患者的ROC曲线下面积（AUC）为0.751（P＜0.05）,显著高于X5和ΔFres（P＜0.05）。ΔX5判断肺气肿优势型慢阻肺患者的最佳界值为:-2.66cmH2O/L/s,以ΔX5≤-2.66cmH2O/L/s判断肺气肿优势型慢阻肺表型的敏感性为62.65%,特异性为93.62%,阳性预测值为:89.66%,阴性预测值为:73.95%。上篇结论脉冲振荡指标中吸-呼双相X5的差值（ΔX5）是反映肺气肿严重程度的有效指标,可用于慢阻肺气流受限异质性的评估。下篇BMP7在慢阻肺气道病变中作用的研究研究背景慢阻肺的气道病变既是慢阻肺持续症状产生的原因,又是气流受限的主要病理解剖基础。慢阻肺的气道病变累及大、小气道,反复的气道炎症损伤、异常修复,导致胶原沉积增多、瘢痕组织形成、气道结构重塑,造成气道狭窄、数量减少、气流阻塞。迄今慢阻肺持续气道炎症、粘液高分泌、鳞状上皮化生、结构重塑的机制远未得到充分阐明。目前公认的慢阻肺发病过程主要为:呼吸道暴露于香烟烟雾、有机粉尘及大气污染等因素后,发生炎症反应、损伤,在炎症反应放大并持续的同时,启动气道-肺组织重塑等方面的病理过程。呼吸道上皮组织作为第一道屏障,不可避免、无可选择地接受着各种有害刺激而引起损伤,同时在接受刺激后可产生多种物质,诸如趋化因子、激活刺激因子、生长因子,等。由于慢阻肺对外界刺激的异常增高的炎症反应,上述物质在慢阻肺患者很可能出现异常表达进而引起一系列的病理变化。观察研究慢阻肺患者气道上皮组织中这些物质产生的差异及其后果,将有助于阐明慢阻肺的发病机制,并提出新的防控策略。我们在前期的研究工作中注意到,在稳定期慢阻肺患者诱导痰中骨形态发生蛋白7（Bone Morphogenetic Protein-7,BMP7）的水平显著高于对照组,进一步肺组织免疫组化结果显示,慢阻肺气道上皮BMP7表达显著高于对照组。BMPs系TGF-β超家族下的一个重要亚组,因其可在体外环境下诱导骨的形成而得名,迄今已发现20多个BMP亚组成员,BMP7是该亚组中被重点关注的分子。BMP7在人体内多种组织中表达,包括胸腺、骨髓、心脏、肾脏、肺和前列腺等。大量研究证实,BMP家族可广泛参与除成骨以外的多种生命活动,调控多种细胞的生长、分化和凋亡过程,包括上皮细胞、间质细胞、心肌细胞等。既往研究显示,BMP7在慢阻肺和吸烟者气道上皮表达升高,BMP7参与了小鼠气道上皮的上皮-间充质转化（EMT）,但其在慢阻肺发病中的作用尚缺乏研究。我们的问题是:慢阻肺患者气道内高水平的BMP7与其气道病变是否有关?如果有关,BMP7发挥怎样的作用?本研究拟从以下几个方面的工作回答上述问题:1.慢阻肺患者气道上皮BMP7的表达与慢阻肺主要临床指标的相关性分析;2.BMP7对人支气管上皮细胞增殖、分化影响的研究;3.BMP7对人支气管上皮细胞凋亡的作用及机制探讨。第一章慢阻肺患者气道上皮BMP7表达与主要临床指标的相关性分析目的研究慢阻肺患者肺组织气道BMP7表达水平及其与吸烟史、气道数量、气道壁厚度和肺功能FEV1的相关性,检测慢阻肺患者诱导痰中BMP7和IL-6,IL8等细胞因子水平,并分析之间的相关性。材料方法1.肺组织标本研究组（1）纳入因肺部病变于山东大学齐鲁医院行肺叶切除术患者。分组:慢阻肺组、吸烟对照组和非吸烟对照组。收集远离病变边缘5cm以上的肺组织标本。免疫组化检测BMP7在气道上皮的定位和表达情况。（2）收集人口学、肺功能和胸部定量CT资料。肺功能指标包括:FEV1、FVC、FEV1/FVC。胸部定量CT检测指标:①气道参数:右上肺气道数量（4-9级支气管计数）、周径10mm的气道壁面积的平方根（Pi10）;②肺气肿指数（%LAA-950）。（3）对气道上皮BMP7表达水平和胸部定量CT气道参数、肺气肿指数和FEV1进行相关性分析。2.诱导痰研究组（1）研究对象:纳入2017.6至2019.11期间就诊于我院的患者,分组:慢阻肺组和对照组。①慢阻肺组:符合GOLD2016诊断标准的稳定期慢阻肺患者;②对照组:无呼吸系统症状、无慢性呼吸系统疾病、肺通气功能正常的受试者。采用高渗盐水雾化10min诱导留取痰标本,获取上清。（2）诱导痰上清液BMP7水平检测:运用Luminex液相芯片技术,检测诱导痰上清液的7种细胞因子的水平:BMP7,BMP4,IL-6,IL-8/CXCL8,IL-1β,CCL18,MMP-12。（3）对诱导痰上清液BMP7水平与IL-1β、IL-6、IL8水平和FEV1%进行相关性分析。结果1.肺组织标本研究（1）一般资料比较:肺组织标本研究组纳入慢阻肺患者35例,吸烟对照者27例,非吸烟对照者25例。3组受试者的年龄无显著差异（P=0.279）。（2）BMP7在气道上皮表达分布:BMP7在大气道上皮基底侧表达较高,在小气道上皮全层均有表达。此外,BMP7在气道粘液腺上皮细胞也有表达。（3）BMP7在慢阻肺气道上皮表达情况:慢阻肺组气道上皮BMP7表达显著高于吸烟对照组（P＜0.001）和非吸烟对照组（P＜0.001）;吸烟对照组气道上皮BMP7表达量高于非吸烟对照组（P＜0.001）。（4）气道上皮BMP7表达与定量CT指标相关性:气道上皮的BMP7表达与右肺4-9级支气管计数呈负相关（r=-0.454,P=0.0173）,与气道壁厚度指标Pi-10呈正相关（r=0.374,P＜0.001）,与肺气肿指数%LAA-950呈正相关（r=0.355,P＜0.001）。（5）气道上皮BMP7表达量与肺功能指标FEV1.0%呈负相关（r=-0.401,P＜0.001）。2.诱导痰研究（1）一般资料比较:诱导痰组纳入42例慢阻肺患者,38例健康对照组。两组的年龄、性别比例和BMI均无显著差异（P值均大于0.05）。（2）慢阻肺诱导痰BMP7水平:慢阻肺组诱导痰BMP7水平显著高于对照组（355.38±287.64 VS 213.56±85.73 pg/mL,P=0.013）。（3）慢阻肺诱导痰炎性性因子水平:慢阻肺组诱导痰IL-6、IL-8和IL-1β水平显著高于对照组（P值均小于0.05）。（4）慢阻肺诱导痰BMP7水平与炎性因子指标相关性:慢阻肺诱导痰BMP7水平与IL-6（r=0.461,P＜0.001）、IL-8（r=0.306,P=0.005）和IL-1β（r=0.246,P=0.027）水平均显著相关。（5）慢阻肺诱导痰BMP7水平与肺功能指标FEV1%呈负相关（r=-0.242,P=0.029）。小结1.慢阻肺气道上皮BMP7表达水平显著高于吸烟对照组和非吸烟对照组;2.慢阻肺气道上皮BMP7表达水平与CT测定的气道数量负相关,与气道壁厚度正相关,与FEV1负相关。3.慢阻肺诱导痰上清液中BMP7水平高于对照组,与诱导痰IL-6、IL-8、IL-1β水平正相关。第二章BMP7对人支气管上皮细胞增殖和分化影响的研究目的第一章研究表明,慢阻肺患者气道内BMP7异常高表达,并且与4-9级支气管数量、Pi-10等气道重塑指标相关;由于气道上皮细胞的异常增殖与分化是导致慢阻肺气道上皮再生紊乱的直接原因,而BMP7的重要生物学功能是调控上皮的生长、分化和凋亡等过程,本部分我们针对BMP7的生物学功能研究BMP7对支气管上皮细胞增殖、分化作用的影响。材料方法1.人原代支气管上皮细胞（Human primary bronchial epithelial cells,HPBECs）的培养和鉴定:纳入就诊于山东大学齐鲁医院行支气管镜检查的肺通气功能正常非吸烟者,刷检获取支气管上皮细胞,应用PneumaCult基底细胞培养基体外培养HPBECs。通过气道上皮基底细胞的标志物KRT5和p63行免疫荧光双染进行鉴定。2.BMP7对HPBECs增殖的影响:实验分组:（1）rhBMP7（100ng/ml）处理组;（2）rhBMP7（100ng/ml）联合BMP通路抑制剂LDN193189（50nM）处理组;（3）空白对照组。处理时间:48h。EdU实验检测细胞增殖能力。3.BMP7对HPBECs分化的影响:（1）BMP7对贴壁培养HPBECs分化的影响实验分组:①rhBMP7浓度梯度处理组:0,10,20,40,80 ng/ml处理细胞,处理时间为 72h;②rhBMP7（40ng/ml）处理组、rhBMP7（40ng/ml）联合 BMP 通路抑制剂LDN193189（50nM）处理组和对照组,处理时间为72h;Western Blot（WB）检测支气管上皮分化指标:鳞状化生标志物involucrin和纤毛细胞标志物FOXJ1;（2）BMP7对气-液相界面培养（ALI）气道模型细胞分化的影响:①气液相界面培养气道模型的建立:将细胞接种于Transwell上室中培养,下室加入分化培养基,细胞暴露于空气,使其分化出假复层纤毛柱状上皮,建立气道模型。②在ALI气道模型中,给予rhBMP7（40ng/ml）处理,WB和免疫荧光检测involucrin和FOXJ1的表达情况。结果1.HPBECs的鉴定:免疫荧光染色显示,95%以上的HPBECs同时表达KRT5和p63,其中KRT5表达于细胞浆和细胞膜,P63表达于细胞核。2.BMP7对HPBECs增殖的影响:rhBMP7组EdU 阳性细胞比例较对照组显著减少,rhBMP7+LDN193189组EdU 阳性细胞比例较rhBMP7组显著升高（P值均小于0.05）,提示BMP7抑制HPBECs增殖。3.BMP7对HPBECs分化的影响:（1）BMP7对贴壁原代人支气管上皮细胞分化的影响:10ng/ml组Involucrin和FOXJ1表达与对照组无显著差异（P值均＞0.05）,20、40、80ng/ml组的involucrin表达显著高于对照组（P值均＜0.05）,FOXJ1表达显著低于对照组。与rhBMP7（40ng/ml）处理组相比,同时给予rhBMP7（40ng/ml）和BMP通路抑制剂LDN193189（50nM）处理组的involucrin表达量显著减少（P＜0.05）,FOXJ1 表达量显著增加（P＜0.05）。（2）BMP7对气-液相界面培养（ALI）气道模型细胞分化的影响:HPBECs经气-液相界面培养4周,显微镜下观察到多层细胞形成和纤毛的出现。WB和免疫荧光结果显示:在ALI气道模型中,rhBMP7（40ng/ml）处理组involucrin表达显著高于对照组,FOXJ1表达显著低于对照组（P值均＜0.05）。小结1.BMP7抑制人支气管上皮细胞的增殖能力。2.BMP7可促进人支气管上皮细胞鳞状化生,抑制纤毛细胞分化,参与慢阻肺气道重塑过程。第三章 BMP7对人支气管上皮细胞凋亡的作用及其机制探讨目的本篇第二章的研究表明,BMP7对人支气管上皮细胞的增殖和分化都存在明显的不良影响。这种对气道上皮生物学功能的负面作用可能进一步导致上皮细胞重组,引起细胞增殖/死亡的失衡状态。异常的凋亡是气道重塑过程中的重要环节,我们推测BMP7可能参与气道上皮细胞凋亡的调控。本部分研究拟对BMP7在气道上皮细胞凋亡中的作用及其机制进行探讨。材料方法1.BMP7过表达HPBECs的构建和验证:运用BMP7过表达慢病毒（OE-BMP7-LV）和空载体的慢病毒（NC-LV）转染HPBECs,经嘌呤霉素筛选,构建BMP7过表达HPBECs,WB验证BMP7过表达。2.实验分组:①BMP7过表达组（OE-BMP7-LV）和阴性对照组（NC-LV）;②BMP7过表达组和BMP7过表达+LDN193189（50nM）组;3.运用AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡;4.WesternBlot 检测凋亡相关蛋白:Cleaved-caspase3、BCL-2/BAX 的表达。5.BMP7调控支气管上皮细胞凋亡的机制探讨:（1）对BMP7过表达组和阴性对照组人原代支气管上皮细胞进行蛋白组学检测,对比差异表达蛋白;（2）分析和筛选与细胞信号转导相关的差异表达蛋白;（3）通过干预差异表达蛋白相关的细胞信号通路,探讨和验证该信号通路在BMP7调控支气管上皮细胞凋亡中的作用。结果1.BMP7过表达HPBECs的验证:OE-BMP7-LV转染组的BMP7蛋白表达量较阴性对照（NC-LV）组显著增加（P＜0.05）。2.BMP7过表达促进HPBECs凋亡:流式细胞学结果显示,BMP7过表达组早期凋亡比例显著高于对照组（12.1±2.2%VS 5.26±1.16%,P=0.015）,BMP7过表达+LDN193189（50nM）组早期凋亡细胞比例低于BMP7过表达组（9.29±1.55%VS 5.24±0.92%,P=0.0042）。3.BMP7对凋亡相关蛋白表达的影响:与阴性对照组相比,BMP7过表达组HPBECs的Cleaved-caspase3表达量显著增加,BCL-2蛋白表达量显著降低,BAX蛋白表达量显著升高（P值均＜0.05）。在BMP7过表达组,运用LDN193189处理可显著减少Cleaved-caspase3蛋白表达,并导致BCL-2蛋白表达升高和BAX蛋白表达显著降低（P值均＜0.05）。4.BMP7调控HPBECs凋亡的机制探讨:（1）BMP7过表达的HPBECs蛋白组学改变:BMP7过表达组与对照组相比,有189种蛋白表达上调,169种蛋白表达下调,其中有44个蛋白与信号转导相关。按照差异表达倍数进行排序,MAP2K7（又称MKK7,丝裂原激活蛋白激酶激酶7,可特异性激活JNK信号通路）蛋白在两组中表达差异最大（2.698倍）。（2）WB结果显示,BMP7过表达组的MKK7表达量和JNK2磷酸化水平（p-JNK2）显著高于对照组（P值均＜0.05）。（3）抑制JNK信号通路降低了BMP7过表达诱导的支气管上皮细胞凋亡:①JNK通路抑制剂SP600125可显著降低BMP7过表达组的JNK2磷酸化水平;②流式细胞学结果显示,BMP7过表达+SP600125组的早期凋亡细胞比例显著低于BMP7过表达组（5.28±0.86%VS 9.74±0.60%,P=0.018）;③WB结果显示,BMP7过表达+SP600125组的Cleaved-caspase3表达水平显著低于BMP7过表达组（P＜0.05）。小结BMP7过表达可促进人支气管上皮细胞的凋亡,该作用通过调控MKK7/JNK2信号通路、激活Caspase3途径实现。下篇结论1.慢阻肺气道上皮BMP7表达升高,且与定量CT气道重塑指标相关。2.BMP7可抑制人支气管上皮细胞的增殖能力,促进人支气管上皮细胞鳞状化生,抑制纤毛细胞化生。3.BMP7过表达可促进人支气管上皮细胞的凋亡,该作用可能通过调控MKK7/JNK2信号通路、激活Caspase3途径实现。全文结论1.脉冲振荡指标中吸-呼双相X5的差值（ΔX5）是反映肺气肿严重程度的有效指标,可用于慢阻肺气流受限异质性的评估。2.慢阻肺气道上皮BMP7表达升高,BMP7可抑制人支气管上皮细胞的增殖、促进鳞状化生、抑制纤毛化生,并可通过MKK7/JNK2信号通路促进人支气管上皮细胞的凋亡,从而在慢阻肺气道病变中发挥作用。