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本研究以猪伪狂犬病毒(PRV)Fa株的毒种为材料,扩增克隆gD基因,同时利用所获得的目的基因进行原核表达载体构建、表达及真核表达载体构建及免疫效力的研究,主要研究内容如下:1.gD基因的分子克隆与序列分析参照GenBank中登录号为AY217094的PRV Fa株的gD基因序列,利用Olig06.0和Premier软件辅助设计1对引物,以Vero细胞增殖培养的PRV为材料,采用PCR技术扩出gD基因,用TA克隆法连接到pMD18-T-vectot载体上,构建克隆重组质粒pMD-gD。并将阳性菌送公司测序,序列测定显示,克隆出1245bp片段,包含1个1209bp的ORF框,编码402个氨基酸。将测序结果及推导的氨基酸序列与国内外的不同来源的12个毒株进行生物学信息比较分析,克隆的gD基因核苷酸序列同源性在98.2%～99.6%,氨基酸同源性在96.3%～98.8%,不同的PRV毒株间的gD基因在核苷酸水平和氨基酸水平上是高度保守的。2.gD基因原核表达载体构建及活性检测为了扩增出去信号肽的gD基因(gD-n),重新设计1对引物,以pMD-gD为材料,采用PCR技术扩出目的基因,用TA克隆法连接到pMD18-T-vector载体上,构建克隆重组质粒pMD-gD-n,将酶切鉴定正确的阳性菌送公司测序,测序结果与模板中去掉信号肽的对应序列完全一致。用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶切下目的基因(gD-n),再定向连接到pET32a+中,获得重组原核表达载体pET-gD-n。酶切鉴定正确后转化到高效表达菌株E.coliBL21(DE3)进行表达研究。经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测显示,约在63.8KDa处出现一条特异表达带,原核重组表达载体pET-gD-n表达出与预期推测的融合目的蛋白,Western Blot检测显示表达的去信号肽融合目的蛋白具有特异的反应原性。3.gD基因核酸疫苗构建及其免疫效力的研究以pMD-gD为材料,用EcoRⅠ和XbaⅠ限制性内切酶切下目的基因,再定向连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)、pCI-neo中,再用相同的内切酶酶切鉴定,成功构建重组真核表达载体pcD-gD,pCI-gD。本实验将PRV gD基因的2个核酸疫苗pcD-gD,pCI-gD和细胞因子IL-15的表达质粒免疫小鼠,肌注免疫Balb/c小鼠两次,于首免后第2、4、6、8周采2份血样,一份分离血清,做间接ELISA抗体检测和中和抗体检测;一份加抗凝剂,做外周血CD4+,CD8+T淋巴细胞的测定。与空白和空载体比较,构建的2个真核表达载体都诱导小鼠产生PRV的特异性IgG抗体和中和抗体,第2次加强免疫后,抗体得到明显的提高,整个实验过程产生的抗体没有超过阳性对照灭活PRV组的水平。但是整个抗体水平相对稳定,提示DNA疫苗诱导的抗体维持时间较长。重组真核表达载体pcD-gD,pCI-gD刺激机体产生CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞方面较为显著,与阳性对照没有明显的差异。攻毒保护实验进一步证实构建的基因疫苗能够抵抗病毒攻击。可见构建的核酸疫苗能够产生良好的体液免疫和细胞免疫应答。将细胞因子IL-15的表达质粒与pcD-gD,pCI-gD联合免疫,结果表明抗体水平和细胞免疫水平明显高于单独免疫组,特别是能显著增强重组质粒引起的CD8+T淋巴细胞的含量。