血管生成对肿瘤的生长和转移有着重要作用，使肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，促进肿瘤增殖、侵袭。新生血管的生长和成熟是一个复杂的多因子和多信号传导过程的结果，其中涉及到很多血管生成因子，其中最主要的是血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF能与细胞表面的血管内皮生长因子受体结合，通过激活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能，可以促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞内、皮细胞侵润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移。大量结果证明，VEGF在促进肿瘤血管生成过程中起重要作用，阻断VEGF被认为是当前最为有效的抗肿瘤治疗方法之一。 肿瘤的发生发展是个多因素多机制多种因子参与的过程。有研究发现，在肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌等多种癌组织中均可发现骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)表达增加。进一步研究发现，人骨桥蛋白是一种含314个氨基酸残基的磷酸化糖蛋白，含有凝血酶的的酶切位点，参与调节细胞骨架重构、细胞凋亡、细胞增殖和迁移等过程，且OPN受体和血管重建关系密切，整合素αvβ3和OPN的共同表达可以刺激内皮细胞迁移。Hirama等证实，OPN在肿瘤生长过程中新生血管形成的机制起到了重要的作用。因此，抑制OPN的活性可阻断肿瘤血管生成，抑制肿瘤的生长。 大量研究表明，VEGF和OPN在血管生成的机制中有很大关联．VEGF可诱导内皮细胞编码αvβ3的mRNA增加，使新生血管表面有αvβ3高水平表达．而VEGF同样也可以诱导编码OPN的mRNA增加，而OPN是αvβ3的配体，二者相互作用可促进内皮细胞迁移．VEGF可以迅速增加微血管的通透性，导致包括凝血因子在内的血浆蛋白浓度增高，上调一些蛋白分子的表达，如生长因子，粘附分子，蛋白酶，蛋白酶受体，易于激活外源性凝血途径，产生凝血酶，促进OPN的酶切。体外实验结果证实，经凝血酶酶切的OPN，其粘附力比未经酶切者强，能大大提高内皮细胞的迁移速度，促进微血管的生成。此外，OPN还能激活Brk/NF-nB/ATF-4信号转导途径来诱导VEGF的表达，并促进VEGF诱导内皮细胞增生的作用，进而促进新生血管形成，加快肿瘤细胞的生长及转移。所以，如果能阻断OPN，不但可以抑制其促肿瘤血管生成的作用，还可以下调VEGF的表达，进而阻止VEGF介导的肿瘤新生血管的形成。 由上可知，如果能同时阻断VEGF和OPN，不但可以抑制VEGF的促血管生成的功能和OPN的促进肿瘤转移的功能，还将降低内源性VEGF的表达，进而可进一步抑制VEGF的促血管生成作用，并减少其介导的OPN的酶切，从而抑制OPN的促进血管生成和肿瘤转移的功能，故可能会比单独阻断VEGF或OPN有更好的抑制肿瘤生长转移的协同作用，对肿瘤的治疗将具有重要意义。 Genentech公司的抗癌新药Avastin(抗VEGF人源化抗体)已于2004年2月获得美国FDA批准上市，用于一线治疗转移性结直肠癌，并有望用于其它肿瘤，包括非小细胞肺癌和肾癌的治疗。我们前期的研究得到一个特异性抗OPN的人源化抗体hu1A12，该人源化抗体，可特异性阻断OPN，在体内外有明显的抗肿瘤活性。若将Avastin和hu1A12联合应用，可同时阻断VEGF和OPN，进一步提高抗肿瘤治疗效果。但是，单抗联合应用具有很多限制。首先，临床上同时应用两种抗体的的安全性和效果至今未有详尽的报道，可能存在安全风险；另外，联合应用两种抗体也存在调节障碍和造价太高的缺陷，限制了其临床应用。 采用基因工程技术构建的双特性抗体可以同时阻断两个靶点。在本研究中，我们设计了一种新型的可同时阻断VEGF和OPN的双可变区的人源化抗体DVD(dual-variable-domain)-IgAVOPN，并在哺乳动物细胞表达系统中获得了高效表达。我们构建的该人源化DVD-Ig AVOPN来源于两个特异的人源化抗体，即抗VEGF的人源化单克隆抗体Avastin和抗OPN的人源化单抗hu1A12。将Avastin的重链可变区通过ASTKGP构成的linker与hu1A12的重链可变区的N末端串联在一起构成了AVOPN的重链可变区，然后与抗体的Fc段连接，构建出AVOPN的重链基因；将Avastin的轻链可变区通过TVAAP构成的linker与hu1A12的轻链可变区的N末端串联在一起构成了AVOPN的轻链可变区，然后用overlap的方法连接上CK，构建出AVOPN的轻链基因。将上述轻重链基因分别装入真核表达载体pcDNA3.1(+)，共转染CHO细胞，westernblot检测正确表达后，挑选出稳定高表达的克隆大量扩增表达，收集培养上清以rProteinA凝胶层析柱纯化，SDS-PAGE检测蛋白，鉴定了蛋白分子量与理论分子量相符，纯度可达90％。ELISA结合实验表明该DVD-Ig可同时结合VEGF和OPN，且与VEGF的亲合力和Avstin相似，与OPN的亲合力和hu1A12相似，说明该DVD-Ig结构既可有原来两种抗体的特异性，又保留了母源抗体的亲合力。 用人脐静脉内皮细胞增殖试验、划痕修复试验检测该DVD-IgAVOPN对VEGF和OPN的阻断作用。实验结果表明AVOPN可有效地抑制VEGF和OPN介导的人脐静脉内皮细胞增殖及划痕修复，与Avastin和hu1A12联合使用达到近似效果。右胁侧接种LM3肿瘤细胞的裸鼠用DVD-Ig AVOPN进行治疗，实验结果表明DVD-IgAVOPN具有比Avastin和hu1A12单独使用有更好的抑制血管生成作用，可显著抑制肿瘤的生成和转移，与两倍剂量的Avastin和hu1A12联合使用效果相当。 综上所述，我们构建了一个四价双特性DVD-Ig，既保留了Avastin和hu1A12的亲合力，能同时阻断VEGF和OPN，有效抑制血管的生成，减少肿瘤的血液供应，抑制肿瘤的生长，显示出良好的体内抗肿瘤作用，可能发展成为一个新型高效的抗肿瘤治疗性抗体。