番木瓜(Carica papaya)位居世界最有营养价值十大水果首位,是热带地区重要的消费和出口水果。番木瓜环斑病毒病(papaya ringspot virus;PRSV)是番木瓜生产上最大的限制因子,危害严重时可导致大幅度减产甚至绝收。海南是我国最大番木瓜种植区,目前生产上还没有表现较好的抗番木瓜环斑病毒病品种,番木瓜产业受到该病的严重威胁。由于缺少抗病种质,常规育种方法不能培育出抗病毒品种;且此种病害尚无有效药剂治理;因而采用转基因策略培育抗病品种是解决番木瓜病毒病危害经济有效的最主要途径之一。PRSV存在地理株系,不同地域的病毒株系有差异,已有的研究发现,转夏威夷或台湾PRSV外壳蛋白基因的品种只对夏威夷或台湾的病毒株系具有较好的抗性。因而尽管转基因番木瓜“Rainbow”于1998年就在美国通过安全性评价被批准商业化,是全球商业化应用较早的转基因农作物之一,但它只对夏威夷的PRSV株系有抗性,而不能为其他地区所推广应用。迄今为止,被实际生产上应用的番木瓜抗病毒基因都是来自其病毒本身的基因,这类转基因番木瓜的抗病行为是由RNA所诱导的转录后基因沉默(RNA-mediated post-transcriptional gene silencing;PTGS)后所致,亦即RNA干扰。RNAi(反向重复双链RNA分子)被认为是最适宜的RNA沉默启动者,一般来说转病毒单链正义或者反义基因赋予植物的病毒抗性只有20%左右,但是转入能够产生dsRNA的反向重复IR序列的植物对病毒的抗性却高达90%。本研究在对海南PRSV株系进行多样性分析和对关键基因保守序列分析的基础上通过分析不同PRSV株系关键基因的保守序列并采用RNAi发夹结构高效抗病设计策略进行三类载体构建,通过优化后的遗传转化体系进行转化,获得3000多个转化体,从中分子鉴定、筛选出一批高效广谱性抗病株系已进入转基因生物安全评价程序,为尽快培育出抗病优质高产新品种打下了良好的基础。主要研究结果如下:1、通过调查、采样、PCR鉴定、测序、聚类分析等工作,对海南的PRSV病毒株系的种类与分布,在生理水平和分子水平上进行了研究。(1)确认了早期发现的两类海南PRSV类型(Hainan Ⅱ,and Ⅲ);(2)发现和报道了一个新的PRSV类型(Hainan Ⅰ);(3)三种类型的PRSV在海南不同种植区间分布不同,Hainan Ⅰ组株系主要分布在三亚,Hainan Ⅱ组株系主要分布在澄迈,HainanⅢ组株系主要分布在文昌和昌江,乐东位于3类株系的交汇处,病毒株系最为复杂,变异多样;(4)对海南PRSV种类与分布的调查和接种鉴定结果,证实了台湾和夏威夷的转基因番木瓜不抗海南的PRSV株系;(5)由于受达尔文和非达尔文选择的极大影响,海南PRSV具有较高的变异率,需要在育种中加以考虑。2、根据前人番木瓜抗病转基因育种经验,选择PRSV病毒重要功能基因 CP、Nib、Hc-Pro为研究对象,针对这些基因挑选海南各地区有代表性的株系进行测序,将测序结果进行生物信息学比对,找到这些基因功能区的保守区域,克隆海南PRSV典型株系关键基因保守区域;利用CP、RPa Hc-Pro基因功能区的保守区域构建高效RNAi干扰载体转化番木瓜,获得批量转基因株系;该设计结合了分别转化CP、RP、Hc-Pro基因使番木瓜获得抗PRSV的成功经验和不足,并且将RNAi的设计理念引入番木瓜抗病基因工程育种中。3、在分子水平上对转基因番木瓜株系进行鉴定;扩繁转基因株系,在实验室和温室条件下对转基因株系的抗病能力与抗病范围进行评估。4、下一步工作重点是进一步开展转基因番木瓜株系及第三代抗性植株的抗性及抗性稳定性评价,完成转基因生物安全评价的相关实验。本论文综合应用病毒学、生物信息学、抗病生理学、分子生物学、转基因遗传育种学等多种技术手段,培养具有高效广谱抗海南PRSV转基因番木瓜新种质,项目的成功将获得具有我国自主知识产权的、在我国海南及华南地区广谱抗番木瓜环斑病毒的转基因当家品种,将大大推进我国番木瓜产业的发展。