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低聚乳果糖(lactosucrose,LS)是由半乳糖、葡萄糖和果糖构成的一种功能性三糖,具有改善肠道微环境、促进钙吸收、调节免疫、预防肥胖等优良生理功能。利用β-半乳糖苷酶、β-呋喃果糖苷酶、果聚糖蔗糖酶的转糖基反应,以蔗糖和乳糖为底物进行生物催化是合成低聚乳果糖的重要方法。现阶段,针对这些酶法合成低聚乳果糖的研究主要在高效野生菌株的筛选、固定化、分子改造、基因工程菌株的构建几方面。已有报道的基因工程菌大多以大肠杆菌作为表达宿主,存在安全性方面的制约,而枯草芽孢杆菌有着长期制备发酵产品的历史,具有培养简单、蛋白分泌能力强、非致病性等特点,同时也是一种食品级微生物。本研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为宿主,利用无抗生素抗性基因的质粒对来源于肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides B-512 FMC)的果聚糖蔗糖酶基因进行克隆,构建果聚糖蔗糖酶的表达系统,为其进一步食品级应用奠定基础。设计不同引物克隆了来源于肠膜明串珠菌L.mesenteroides B-512 FMC的果聚糖蔗糖酶基因和枯草芽孢杆菌表达载体pUB-P43-DPE-dal基因,再利用重叠延伸PCR技术构建了分别含有双启动子pUB-P43-HPAII-LEME-dal和单启动子质粒pUB-P43-LEMEdal、pUB-HPAII-LEME-dal的重组质粒。将三种质粒分别导入带丙氨酸筛选标记的枯草芽孢杆菌B.subtilis 1A751(dal-)和B.subtilis WB600(dal-)中,构建六株重组基因工程菌1A-PH、1A-P、1A-H、WB-PH、WB-P、WB-H。经过对比得到了发酵酶活最高的一株重组菌株WB-PH。通过发酵培养进行目的蛋白的异源表达,并用Ni2+亲和层析柱对目的蛋白进行纯化,经过SDS-PAGE凝胶电泳分析、酶反应产物高效液相色谱检测,确认了该酶的正确表达及产低聚乳果糖的能力。研究了重组果聚糖蔗糖酶的酶学性质,发现其最适温度为40°C,在40°C以下较稳定,当温度大于50°C时,该酶迅速失活,热稳定性较差;该酶的最适pH为6.5,在pH6.0~6.5范围内相对稳定。确定了合成低聚乳果糖的最佳反应条件,底物为150 g/L的蔗糖和150 g/L的乳糖,加酶量为20 U/g底物,反应温度为40°C,反应1.6 h后达到反应平衡,底物转化率达30%~35%。研究了培养基组分和发酵条件的影响。确定了重组枯草芽孢杆菌WB-PH的发酵培养基配方,碳源为20 g/L的葡萄糖,氮源为20 g/L的大豆蛋白胨。摇瓶发酵条件为:培养温度37°C,接种量1%(v/v),装液量5%(v/v),发酵周期18 h,摇床转速200 r/min。在该培养条件下重组枯草芽孢杆菌WB-PH的发酵酶活最高可达108.34 U/mL,相比于优化前提高了25倍。采用发酵罐对重组枯草芽孢杆菌WB-PH初步进行了放大培养,37°C培养15 h后发酵酶活可达78.4 U/mL。