胰岛素分泌缺陷是2型糖尿病发生发展的一个重要病理生理机制。导致2型糖尿病患者胰岛素分泌缺陷的原因是β细胞功能下降以及β细胞的量减少，这是遗传因素和环境因素共同作用的结果。其中，慢性炎症过程是一个重要的环境因素。慢性炎症释放的炎症因子能抑制β细胞的增殖，促进细胞的凋亡，抑制胰岛素的合成和分泌。　　 β细胞胰岛素信号通路中胰岛素受体底物-2(IRS-2)的变化，影响β细胞功能和存活。下调IRS-2的表达或干扰其酪氨酸磷酸化能抑制β细胞的增殖、胰岛素的合成和分泌；上调IRS-2的表达则能促进β细胞的增殖，拮抗β细胞的凋亡，促进胰岛素的分泌。炎症因子可通过多条途径抑制IRS-2的酪氨酸磷酸化，以及促进IRS-2的降解。　　 2型糖尿病患者慢性炎症激活的原因和机制是近年来的研究热点。其中，肠道细菌产物脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可能参与了2型糖尿病患者慢性炎症的激活。脂多糖也被称为内毒素，是革兰氏阴性细菌(G-菌)外膜的主要成分，在G-菌破解后得以释放。人体肠道中含有大量G-菌，可持续产生大量的LPS。高脂饮食能促进LPS吸收，引起血浆LPS水平升高。2型糖尿病患者在没有明显全身感染证据的情况下，与姓别、年龄和BMI匹配的非糖尿病者相比，血浆中LPS水平明显升高。　　 LPS在单核巨噬细胞膜上的CD14协助下与TLR4/MD2受体复合物结合，激活TLR4信号通路。其中，通过激活IKK，引起NF-κB的激活，启动多种炎症因子的表达。LPS也被发现能通过激活肝细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞中的IKK，激活NF-κB，上调炎症因子的表达，干扰胰岛素信号传导，引起胰岛素抵抗。多项研究已证实，胰岛β细胞表达完整的LPS认别受体——CD14、TLR4和MD2。而且，LPS能上调胰岛β细胞IL-1、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达。　　 因此，我们推测LPS可作用于β细胞表面的受体，通过激活IKK，诱导IκB磷酸化，激活NF-κB，干扰IRS-2的表达和酪氨酸磷酸化，影响β细胞生长、存活和功能。　　 研究目的:　　 观察LPS对NIT-1β细胞凋亡、增殖和胰岛素分泌功能的影响，并初步探讨其可能机制。　　 研究内容　　 1.检测LPS对NIT-1细胞凋亡的影响。　　 2.检测LPS对NIT-1细胞增殖的影响。　　 3.检测LPS对NTI-1细胞细胞内胰岛素含量、基础及高糖刺激后胰岛素分泌的影响。　　 4.检测LPS对NIT-1细胞IRS-2蛋白表达水平以及酪氨酸磷酸化水平的影响。　　 5.检测LPS对NIT-1细胞IκBα蛋白磷酸化水平的影响，以及其与细胞增殖的关系。　　 研究方法:　　 1.细胞培养　　 DMEM低糖培养基添加10％胎牛血清(内含内毒素≤1ng/ml)用于小鼠胰岛NIT-1β细胞株(20-40代)的培养。　　 2.LPS干预浓度的确定　　 细胞培养24h后换液，分别加入终浓度为0.1、0.5、1、5、10μg/ml的LPS作用120h，普通显微镜下观察细胞的形态和数目，以及用CCK-8试剂盒检测细胞的总活力，取影响细胞总活力的最小有效浓度作后续实验。　　 3.细胞凋亡的检测　　 1μg/ml LPS作用120h后，分别以Hochest33342染色后荧光显微镜下人工计数以及Annexin V/PI染色后流式细胞仪计数检测细胞的凋亡。　　 4.细胞增殖的检测　　 1μg/ml LPS作用24、48、72、96、120h后，分别以CCK-8试剂盒和BrdUELISA试剂盒检测细胞的增殖。　　 5.胰岛素的检测　　 1μg/ml LPS作用24、48、72、96、120h后，放免法检测细胞内胰岛素含量、葡萄糖刺激后的胰岛素分泌和24h的胰岛素基础分泌。　　 6.IRS-2蛋白和酪氨酸磷酸化的检测　　 1μg/ml LPS作用120 h后，Western blot法检测细胞内IRS-2的蛋白表达水平，免疫沉淀后Westem blot法检测IRS-2蛋白的酪氨酸磷酸化水平。　　 7.IκBα蛋白磷酸化的检测，及其与细胞增殖关系　　 1μg/ml LPS作用0、30、60、120 min后，Western blot法检测IκBα蛋白及其磷酸化水平。以IκBα磷酸化抑制剂(Bay11-7082)预处理1h，再加入LPS作用1h后，检测IκBα蛋白及其磷酸化水平。Bay11-7082预处理1h，再加入LPS作用24h后，CCK-8试剂盒检测细胞增殖。　　 8.统计分析　　 实验相同条件下至少重复3次。结果数据以SPSS13.0 for Windows软件进行统计分析。符合正态分布的数据用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD法，P＜0.05视为差异有统计学意义。　　 研究结果:　　 1.镜下观察NIT-1细胞形态和数目　　 LPS(0.1～10μg/ml)作用120h后，细胞形态与对照组相近，LPS1、5、10μg/ml组细胞数目明显减少。　　 2.LPS对细胞总活力的影响　　 与对照组比较，LPS0.1、0.5μg/ml组细胞总活力无明显统计学差异，LPS1、5、10μg/ml组细胞总活力明显下降(P＜0.01)。LPS1、5、10μg/ml组间两两比较，细胞总活力无明显统计学差异。　　 3.LPS对NIT-1细胞凋亡的影响　　 1μg/ml LPS作用120h后，与对照组比较，细胞凋亡率无明显统计学差异(Hoechst33342：对照组2.05±0.34％，LPS组2.36±0.36％，P=0.349；流式：对照组1.93±0.65％，LPS组4.34±1.60％，P=0.072)。　　 4.LPS对NIT-1细胞增殖的影响　　 CCK-8和BrdU检测均显示：1μg/ml LPS作用24、48h，细胞增殖明显高于对照组，约上升9-30％(P＜0.05)；LPS作用72h，细胞增殖与对照料组比较无明显统计学差异；LPS作用96、120h，细胞增殖明显低于对照组，约为对照组的80％(P＜0.01)。　　 5.LPS对胰岛素合成和分泌的影响　　 1μg/ml LPS作用24、48、72、96、120h，与对照组比较，细胞内胰岛素含量、葡萄糖(2.8、11.1mmol/l)刺激1h后的胰岛素分泌以及胰岛素分泌指数均无明显统计学差异。LPS作用24h后，与对照组比较，细胞24h的基础胰岛素分泌量无明显统计学差异；LPS作用48、72、96、120h，细胞24h的胰岛素基础分泌量明显小于对照组，约为对照组的80％(P＜0.01)。　　 6.LPS对IRS-2蛋白的影响　　 1μg/ml LPS作用120h后，与对照组比较，细胞内IRS-2蛋白表达水平无明显统计学差异(对照组2.11±0.22，LPS组1.93±0.15，P=0.313)，而IRS-2蛋白的酪氨酸磷酸化水平明显下降，约降低51％(对照组0.45±0.08，LPS组0.22±0.06，P=0.016)。　　 7.LPS对IκBα磷酸化的影响及其与细胞增殖的关系　　 1μg/ml LPS作用1h后，IκBα蛋白的磷酸化水平明显升高(P＜0.05)。Bay11-7082预处理后，LPS促进的IκBα蛋白磷酸化以及细胞增殖均明显受抑制(P＜0.01)。　　 研究结论:　　 LPS参与调节小鼠NIT-1β细胞的增殖和胰岛素基础分泌，其机制可能与激活NF-κB和抑制IRS-2酪氨酸磷酸化有关。