昆虫嗅觉系统作为昆虫进行觅食、寻偶、交配等一系列生命活动的化学监测器,能特异的识别环境中的信息化学物质。长足大竹象(Cvrtotrachelusbuqueti)是我国南方重要的钻蛀性林业害虫,危害多种丛生竹类,严重影响竹类产业发展。在昆虫世代繁衍过程中,雌雄个体间如何通过嗅觉系统远距离精确搜索定位成为雌雄个体间是否有效交流的关键。本文根据前期高通量测序筛选序列,利用RT-PCR技术成功克隆得到长足大竹象的一个性信息素结合蛋白基因,利用SYBR Green Ⅰ荧光染料法,采用荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)分析了CbuqPBP 在雌雄成虫不同组织中的转录表达谱,并进行表达纯化,运用荧光竞争结合技术对该蛋白与主要虫体挥发物和寄主挥发物等的结合特性进行分析,初步探讨了该蛋白的功能。主要研究结果如下:1.根据前期高通量测序结果(GenBanknumber:SAMN06176790)筛选设计引物,运用RT-PCR技术克隆得到长足大竹象性信息素结合蛋白PBP1基因(Genebank登录号为KU845733.1),编码143个氨基酸,N-末端包含17个氨基酸,预测为信号肽序列。预测蛋白分子量为15.8411 kDa,等电点为4.60,含有6个保守的半胱氨酸位点,具有昆虫PBPs 一级结构的特性。多序列比对和进化树分析结果表明,推定的CbuqPBP1氨基酸序列与鞘翅目和鳞翅目昆虫相似性分别为38.47%、52.39%,与Anomala rufocuprea金龟PBP2、PBP3的相似性较其他种昆虫的PBPs高,且在进化上为同一支系。2.运用qPCR技术,对CbuqPBP1在长足大竹象雌雄成虫不同组织(触角、去触角头、胸、腹末和足)中的分布进行研究。结果表明:CbuqPBP1在长足大竹象雌雄成虫的触角、去触角头和胸部中表达,在腹末和足上不表达,且在触角高丰度表达,在去触角头和胸部极少量表达。对于雌虫和雄虫而言,在有表达的器官中,又都出现雄虫表达量高于雌虫的现象。3.将CbuqPBP1构建到原核表达载体pET-28a(+)中,转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导成功表达,SDS-PAGE检测得到一条16 kD左右的蛋白条带。经优化条件(37℃,3h,IPTG1mmol/L)诱导后融合表达,经镍离子亲和层析、过滤、浓缩得到较高纯度,浓度为345 ng/μL的目的蛋白,为进一步荧光竞争结合试验奠定了基础。4.以1-NPN为荧光探针,研究了 CbuqPBP1蛋白与14种长足大竹象体表挥发物、3种慈竹挥发物和3种虫体-寄主混合挥发物的竞争结合能力。结果表明:CbuqPBP1能够与11种虫体挥发物和3种寄主挥发物有效结合。其中,CbuqPBP1与邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯和邻苯二甲酸二丁酯结合能力最强,结合常数分别为6.49 μM、11.10μM;CbuqPBP1与苯甲醛、芳樟醇、吲哚三种寄主植物挥发物结合能力一般,结合常数分别为28.43 μM、29.77 μM、32.90 μM;苯甲醛、芳樟醇、吲哚与邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯按1:1比例混配后结合能力较3种寄主挥发物单独存在时强了62.3%、65.1%、51.7%。初步推测,CbuqPBP1为长足大竹象性信息素结合蛋白,在感受性信息素中发挥重要作用,而且寄主植物气味化合物的加入可能对雄虫觅偶有增效作用。