【摘 要】
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冠状病毒（Coronavirus）是自2002年非典爆发以来成为重大公共卫生问题的RNA病毒,此次SARS-Co V-2疫情的大流行更是促使人们希望出现一种可以快速生产的疫苗,因此在众多疫苗技术路线中m RNA疫苗技术因其有效性和快速性脱颖而出。其中以Moderna公司的m RNA-1273及辉瑞公司的BNT162b2上市疫苗为代表,二者m RNA序列中均包含全长的S蛋白、5’UTR、3’UTR、
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冠状病毒（Coronavirus）是自2002年非典爆发以来成为重大公共卫生问题的RNA病毒,此次SARS-Co V-2疫情的大流行更是促使人们希望出现一种可以快速生产的疫苗,因此在众多疫苗技术路线中m RNA疫苗技术因其有效性和快速性脱颖而出。其中以Moderna公司的m RNA-1273及辉瑞公司的BNT162b2上市疫苗为代表,二者m RNA序列中均包含全长的S蛋白、5’UTR、3’UTR、Cap帽子、Poly（A）尾及修饰核苷酸,这些结构元件往往用以调控m RNA的稳定性和翻译效率,在微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）的病毒中,其UTR序列及某些结构元件对病毒基因组在宿主细胞内的复制过程行使着较高活性的调控,例如在EV71的基因组序列中,其5’UTR包含一个内部核糖体进入位点（IRES）,该IRES是以一种不依赖于5’Cap的方式指导翻译的起始,3’UTR中含可变的Poly（A）尾,因此设想能否以EV71中5’UTR、3’UTR及其它结构元件来调控SARS-Co V-2 S1亚基的转录及翻译过程,并考量EV71上除VP1蛋白外的其它蛋白能否间接提高S1亚基的免疫效力。基于此本实验将SARS-Co V-2中的S1亚基替换掉EV71全长基因组中的VP1蛋白并搭载于p SP64 Poly（A）载体上构建p SP64 Poly（A）-T（EV71＆Co V）及p SP64Poly（A）-Z（EV71＆Co V）重组质粒,此外还分别将SARS-Co V-2中编码S蛋白、N蛋白的基因序列搭载在p VAXⅠ载体上构建p VAXⅠ-SCo V、p VAXⅠ-SNCo V重组质粒,以此来探索只具备ORF、5’Cap及Poly（A）尾这三种基本结构元件的m RNA（SCo V、SNCo V）在转录、翻译效率及免疫效力上与额外具备EV71的5’UTR、3’UTR及其它结构元件的m RNA（T（EV71＆Co V）、Z（EV71＆Co V））有何区别。为了将上述体外转录的产物m RNA成功递送至胞内并表达目的蛋白,我们采用基于薄膜分散和乙醇注入的原理来制备脂质纳米颗粒溶液,该脂质纳米溶液在1:2±0.5的比例下能够稳定且高效的将m RNA-EGFP递送至293T细胞内并表达绿色荧光蛋白;对脂质纳米溶液进行理化性质表征实验显示其透射电镜下呈圆球型,平均粒径小于100 nm且于4℃环境下保持至少90天稳定,PDI小于0.1,ζ电位为20～40 m V,平均乙醇浓度为10.319 ng/μL;在细胞毒性实验中,在0.4μL/5×10~3个细胞的剂量时其细胞存活率仍维持在83～100%;在凝胶阻滞实验中,当脂质纳米溶液浓度与m RNA浓度之比大于0.5μL 20 m M:0.25μg时才能使脂质纳米溶液完全负载目的m RNA;分别将上述经体外转后加工的m RNA（SCo V、SNCo V、T（EV71＆Co V）、Z（EV71＆Co V））与脂质纳米溶液形成复合物,以Recombinant SARS-Co V-2 Spike S1（mutations）Protein（His Tag）为对照分别免疫BALB/c雌性小鼠,ELISA法检测血清Spike Ig G抗体浓度显示GroupⅡ组于第28天产生均值约8552.59 ng/m L的Spike Ig G抗体浓度,m Z（EV71＆Co V）组于第14天和第45天分别产生均值约697.833 ng/m L和744.57 ng/m L的Spike Ig G抗体浓度,而GroupⅠ组、m SCo V、m SNCo V组及m T（EV71＆Co V）组与Placebo组相比无显著性差异;此外ELISpot检测IL-4细胞因子实验结果显示除GroupⅠ和GroupⅡ组分别产生均值约431.833 SFU/10~6淋巴细胞、570.5 SFU/10~6淋巴细胞的IL-4以外,其余各组与Placebo组相比均无显著性差异。上述结果提示在细胞水平上脂质纳米溶液能够将m RNA递送至293T细胞中并表达相应的蛋白,在动物水平上由于剂量或脂质纳米溶液配比而影响其递送效率,但m Z（EV71＆Co V）组实验结果提示不同序列结构元件的m RNA在一定程度上对其免疫效力有些许影响。
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