论文部分内容阅读
第一部分靶向VEGF siRNA重组腺病毒构建及鉴定目的构建携带靶向血管内皮生长因子小干扰RNA(VEGF siRNA)的重组腺病毒质粒,收获高滴度的重组腺病毒,为进一步研究提供载体工具。方法采用定向克隆的方法将靶向VEGF siRNA插入穿梭质粒pSES-HUS,酶切及基因测序鉴定,命名为pSES-VEGFsi;采用同源重组方法将pSES-VEGFsi与腺病毒骨架质粒pAdEasy-l连接,构建重组腺病毒质粒pAd5-VEGFsi。酶切鉴定pAd5-VEGFsi,以脂质体介导法将其导入包装细胞HEK293,荧光显微镜观察pAd5-VEGFsi在细胞内包装及扩增,通过乒乓感染并用氯化铯密度梯度离心法获得高滴度的重组腺病毒Ad5-VEGFsi。结果(1)酶切及基因测序证实重组腺病毒质粒pAd5-VEGFsi构建成功。(2)荧光显微镜证实重组腺病毒Ad5-VEGFsi成功导入HEK293包装细胞,在细胞内得到良好表达。(3)获得了高滴度重组腺病毒Ad5-VEGFsi,病毒滴度约为4.6x l011 pfu/ml。结论成功构建了携带靶向VEGF siRNA的重组腺病毒质粒,并收获高滴度重组腺病毒Ad5-VEGFsi,为进一步的研究打下了良好的基础。第二部分腺病毒介导靶向VEGF siRNA对K562细胞凋亡及survivin基因表达的影响目的采用腺病毒介导VEGF siRNA(即携带VEGF siRNA的重组腺病毒)沉默白血病K562细胞中VEGF的表达,检测K562细胞增殖及凋亡情况,并进一步检测细胞内survivin基因的表达,探讨VEGF在白血病发病中的作用及VEGF与survivin在白血病发病中的关系。方法应用第一部分成功构建的携带靶向VEGF siRNA的重组腺病毒( Ad5-VEGFsi )感染K562细胞。实验分为三组:实验组(K562/Ad5-VEGFsi)、空载体组(K562/Ad5)、空白对照组(K562)。通过RT-PCR方法分别检测K562细胞内VEGF mRNA及survivin mRNA表达; ELISA方法检测K562细胞培养上清液中VEGF蛋白分泌;Western blot法检测K562细胞内survivin蛋白表达;MTT法检测K562细胞增殖及流式细胞仪检测细胞凋亡。结果(1)三组细胞中均有VEGF mRNA表达及其蛋白的分泌;同时,在三组细胞中也检测到survivin mRNA及其蛋白的表达。(2)实验组VEGF mRNA表达量及其蛋白浓度分别为(0.25±0.06)、(1120.74±14.55)pg/ml,与空载体组及空白对照组相比均明显降低,差异有统计学意义(p<0.01)。(3)实验组survivin mRNA及其蛋白表达量分别为(0.42±0.03)、(0.26±0.01),与空载体组及空白对照组相比也明显降低(p<0.01)。(4)实验组细胞凋亡率为(16.45±0.14)%较空载体组及空白对照组明显增加(p<0.01);实验组细胞的生存力下降,增殖受到抑制,与空载体组及空白对照组相比有显著差异(p<0.01)。结论(1)人白血病K562细胞表达VEGF mRNA并分泌VEGF蛋白。(2)携带靶向VEGF siRNA的重组腺病毒Ad5-VEGFsi可明显抑制K562细胞VEGF mRNA表达及VEGF蛋白分泌。(3)K562细胞感染Ad5-VEGFsi后,细胞凋亡明显增加,生存力降低,增殖受到抑制。VEGF在细胞内的过度表达,使肿瘤细胞具有抵抗细胞凋亡及恶性增殖的能力。(4)随着VEGF表达下降的同时细胞内survivin mRNA及蛋白表达随之降低,提示VEGF与survivin的表达密切相关。综上所述,VEGF的过度表达使白血病细胞具有抵抗细胞凋亡及恶性增殖的能力,而VEGF的这种能力可能是通过上调细胞内survivin基因的表达来实现的。