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灵杆菌非特异性核酸酶（NU）是唯一能降解所有形式核酸的核酸水解酶。该酶可作为常规水解核酸以及蛋白质纯化过程中降解核酸的高效用酶，灵杆菌性核酸酶活性较高，在使用过程中具有用酶量小的显著特征。实验前期对该酶进行了固定化，发现固定化酶有泄露现象，为解决固定化酶的泄露问题，本研究在前期获得重组表达载体pMAL-c4X-NU的基础上将灵杆菌非特异性核酸酶184位残基的组氨酸定点突变为半胱氨酸，并对突变后的核酸酶(H184CNU)再次固定化和检测，优化固定化灵杆菌非特异性核酸酶的条件，并研究固定化酶的酶学特性。通过PCR扩增环状质粒全长的突变方法实现灵杆菌非特异性核酸酶基因的定点突变，获得含有突变位点的灵杆菌非特异性核酸酶重组表达载体pMAL-c4X-NUH184C，将含有突变体的质粒转入大肠杆菌BL21中表达，实现了78kD的H184CNU的可溶性表达。核酸酶酶活测定结果显示，突变前后酶活性没有明显改变； SDS-PAGE电泳结果表明，突变前和突变后核酸酶的表达量没有明显变化，说明突变的位点没有影响到灵杆菌非特异性核酸酶的活性及表达量。通过Swiss-Pdbviewer3.7软件对突变前和突变后核酸酶的3D结构进行预测，结果显示二亚基的184位氨基酸之间的距离由原来的6.34nm缩小为6.26nm，并且带电荷量增加，离子键能增强。本研究采用共价结合法以Sepharose CL6B为载体进行固定化，优化固定化H184CNU的条件，实验结果显示，最佳固定化H184CNU条件为：给酶量0.15mg/mL，温度为20℃，时间6h，pH值为8.0，在此条件下固定化酶酶活回收率高。对固定化的H184CNU上清进行多次检测，未检测到核酸酶活性，说明点突变解决了固定化核酸酶的泄露现象。固定化H184CNU与游离酶特性比较结果显示，固定化H184CNU和游离核酸酶的最适温度分别为43℃和38℃，最适pH均为8.0，固定化H184CNU的热稳定性、pH稳定性及储藏稳定性明显提高，且固定化H184CNU的重复使用稳定性较高。本研究成功的对灵杆菌非特异性核酸酶基因进行定点突变，并对突变后的核酸酶进行固定化研究，解决固定化酶的泄露问题，研究结果为蛋白纯化过程中利用酶法低成本去除核酸奠定基础，同时也提高了灵杆菌非特异性核酸酶的利用效率。