牛病毒性腹泻粘膜病是牛的一种接触性传染病,此病可以感染各个年龄段的牛,在全世界广泛分布。该病能引起患畜高热、口腔及鼻内粘膜出血或产生大量粘液、母牛奶量减少甚至停止产奶、怀孕母牛流产或产死胎、畸形胎等症状。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)与猪瘟病毒和羊边界病毒在血清学上有交叉反应。在BVDV的结构蛋白中,E0基因保守性较高,并且具备一定的免疫原性,因此可作为基因工程的诊断抗原或用于研究基因工程亚单位疫苗。本研究根据已发表的BVDV-EO基因序列设计一对特异性引物。将OregonC24V标准毒接种于MDBK细胞中增殖并收集病毒液,从病毒液中提取RNA。以RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出了921bp的E0基因。之后构建pMD18-T-E0克隆载体,经PCR扩增和酶切鉴定后进行测序。随后利用含有表达E0蛋白的重组质粒pET28a-E0转化至表达菌BL21(DE3)中,经培养诱导表达出重组E0蛋白,经Western blot显示,纯化后的的重组E0蛋白的分子量大小为34kD左右,能与BVDV阳性血清反应,具有生物学活性。用纯化后的E0蛋白作为包被抗原,经试验确定最佳抗原包被浓度为1.23μg/孔,血清最佳稀释度为1：160。特异性试验与重复性试验的结果表明,所建立的间接ELISA检测方法特异性较好,变异性也较小。与商品化BVDV抗体检测试剂盒相比,所建立的ELISA检测方法的敏感性为88.5%,特异性为82.1%,说明该间接ELISA方法具有较小的误差。