论文部分内容阅读
益生菌在水产养殖上的应用备受关注,人们在研究益生菌的有益作用的时候,也逐步意识到在应用过程中可能存在安全隐患。因为益生菌在生长和繁殖过程中会产生一系列代谢产物并且部分代谢产物具有抗菌作用,这部分代谢产物的抗菌成分、特征和功能并不明确,这类益生菌在养殖生产中大量使用是否对养殖水体菌群产生不良影响,是否会对引入地区造成生物入侵,也知之甚少。芽孢杆菌是水产养殖上应用最广泛的益生菌之一,本实验室前期分离到一株对嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）具有良好抑制作用的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）HE,为了探究解淀粉芽孢杆菌对致病性嗜水气单胞菌的抑菌成分以及在水产养殖中应用的安全性,本文开展了以下研究。为明确解淀粉芽孢杆菌HE发酵液中活性成分,测定了解淀粉芽孢杆菌发酵液的理化性质,PCR检测了脂肽合成相关基因,四对引物的扩增产物经过克隆、测序和BLAST分析,以及UPLC-Q-TOF-MS进一步分析其活性物质成分。结果表明,该菌株发酵液具有表面活性且能够抑菌,对高温、酸、碱和蛋白酶具有一定的耐受性;解淀粉芽孢杆菌HE基因组含有ituA、fenB、sfp、mycB的脂肽合成相关基因;脂肽粗提物中含有Surfactin、Iturin和Fengycin这三类脂肽类抗生素的分子量。根据以上结果推测出解淀粉芽孢杆菌发酵液中含有Surfactin、Iturin和Fengycin这三类脂肽类抗生素。为了解HE菌株产生的脂肽对嗜水气单胞菌的抗菌效果,采用二倍稀释法测定脂肽对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）,研究了脂肽对嗜水气单胞菌的生长曲线的影响和杀菌动力学,并从显微结构上探讨其抗菌作用机制。结果表明,脂肽对嗜水气单胞菌MIC和MBC都是137.97μg/mL,脂肽对嗜水气单胞菌的抗菌作用随菌体浓度的升高而减弱,随脂肽浓度的升高或作用时间的延长而增强;脂肽可以导致嗜水气单胞菌细胞膜塌陷和孔洞。通过HE菌株及其代谢产物脂肽对鱼的急性毒性试验,以及HE菌株在综合养殖模型中对养殖水体环境的影响试验评价该菌的安全性。结果表明,HE菌对草鱼、鲫鱼和鲢鱼都有较高的安全性,其代谢产物脂肽对草鱼具有低毒(500mg/Kg<LD50<5000 mg/Kg)。在综合养殖养殖水体环境安全性实验中,每隔七天添加一次浓度为1×1011 cfu/m3的HE菌能在较长时间内显著降低养殖水体中的氨氮、总氮、总磷和化学需氧量（p<0.05）,但亚硝酸盐升高（p<0.05）。处理组的水体菌群多样性显著降低（p<0.05）;对照组以变形杆菌门、放线菌门、蓝藻门、疣微菌门和拟杆菌门为主,与对照组相比,处理组的变形杆菌门和拟杆菌门数量增加,而放线菌门数量减少;在纲水平上,处理组和对照组的水体菌群也存在差异;在属水平上,两组芽孢杆菌属处于同一水平;16SRDNA检测的功能基因推断,水体的自净能力在处理组和对照组之间没有显著差异（P>0.05）。