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冠状病毒是基因组最大的、单股正链RNA病毒。冠状病毒与人类、动物的生命活动息息相关,特别是自然界中和人类生活密切相关的一些动物深受其害。随着人新型冠状病毒的全球大流行,人们对冠状病毒的认识也越来越多,但是冠状病毒的致病机制仍然有待进一步研究。冠状病毒纤突（Spike,S）蛋白可识别并感染宿主细胞,同时也是宿主产生中和抗体的主要靶标。然而,S蛋白对冠状病毒毒力的影响尚不清晰,除S蛋白以外其他基因是否影响病毒毒力也急需验证。冠状病毒反向遗传学系统是研究冠状病毒感染的重要分子生物学方法,通过此方法可操纵冠状病毒基因组水平的RNA,进而快速开展抗病毒药物筛选、毒力基因鉴定、致病机制等相关研究。本课题以α冠状病毒中的猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV）和猫冠状病毒（Feline Coronavirus,FCoV）为研究对象,通过冠状病毒反向遗传学及动物实验等,初步探索了α冠状病毒的致病机制,具体内容如下:1.TGEV感染性克隆的构建及TGEV S基因N端对病毒毒力的影响研究。我们首先以细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）为载体,将TGEV全长基因组cDNA（ORF3区域插入EGFP基因,以便后期观察）及转录调控元件等构建到BAC载体,成功构建出了TGEV感染性克隆p BAC-TGEV-GFP（对应重组病毒TGEV-GFP）。为了研究TGEV S基因N端的结构域（N terminal domain,NTD）对病毒毒力的影响,我们比对了猪呼吸道冠状病毒与TGEV的S基因,发现二者主要差别在于猪呼吸道冠状病毒S基因比TGEV S基因N端少了224个氨基酸;因此,我们构建了TGEV S基因N端缺失224个氨基酸的感染性克隆p BAC-TGEV-GFP-△S＿NTD（对应重组病毒TGEV-GFP-△S＿NTD）。将重组病毒TGEV-GFP及TGEV-GFP-△S＿NTD感染新生仔猪,发现S基因N端缺失的TGEV-GFP-△S＿NTD也能使小猪致死;以上实验结果说明TGEV S基因N端不是TGEV毒力的决定性因素。2.野生型及细胞适应型FCoV毒株全长cDNA的构建及其病毒拯救。我们首先收集自然感染且确诊为传染性腹膜炎猫的病料,提取病料中病毒的RNA,测定病毒基因组序列,最终获得了一株野生型猫传染性腹膜炎病毒（Feline Infectious Peritonitis Virus,FIPV,毒株命名为QS）全基因组序列;与此同时,我们也测定了细胞适应型传代的FCoV 79-1146毒株（毒株命名为79-1146＿CA）全基因组序列。以BAC为载体,我们分别构建了QS及79-1146＿CA毒株的全长cDNA克隆（分别对应质粒p BAC-QS和p BAC-79-1146＿CA）。将全长cDNA克隆转染CRFK细胞进行病毒拯救,发现仅p BAC-79-1146＿CA能拯救出感染性的重组病毒（重组病毒命名为r79-1146＿CA）。为进一步拯救QS毒株,我们将79-1146＿CA的S基因胞外域替换至p BAC-QS（该突变体命名为p BAC-QS-79）,将p BAC-QS-79转染CRFK细胞,发现该S基因嵌合重组病毒rQS-79（对应质粒p BAC-QS-79）能在细胞上很好的增殖。3.FCoV口服感染动物模型的构建及FCoV S基因对病毒毒力的影响研究。将r79-1146＿CA及rQS-79进行口服感染动物实验,研究发现rQS-79能有效感染且保持强致病性,可使患病猫出现典型的FIP症状,并100%致死;而r79-1146＿CA仅造成个别猫轻微的发热,并没有明显的临床症状。该研究首次获得了100%感染致死的猫冠状病毒,也说明FCoV II型S基因并不决定病毒毒力。4.FCoV强、弱毒株口服感染动物模型的应用。我们进一步将rQS-79毒株感染r79-1146＿CA免疫过的猫,发现虽然高滴度中和抗体能使猫FIP症状缓解、生存周期延长,但并不能产生免疫保护。然而,我们将候选药物GS-441524用于治疗rQS-79感染的猫后,发现患病猫的症状很快得到缓解。该研究说明,目前II型FIPV中和抗体对猫传染性腹膜炎的保护效果并不明显,FIPV的治疗可考虑使用抗病毒药物。总之,本课题以α冠状病毒中的典型代表TGEV为研究对象,通过反向遗传学及动物实验,说明了S基因N端缺失并不能使病毒完全致弱。同时,以FCoV为研究对象,通过反向遗传学及重组病毒（r79-1146＿CA、rQS-79）口服感染动物实验,发现FCoV的S基因并不决定病毒毒力,且首次获得了FCoV强、弱毒株感染性克隆。TGEV、FCoV感染性克隆及动物感染模型的构建,为冠状病毒的抗病毒药物筛选、疫苗研发、致病机制的研究等提供了坚实的技术平台。