杂交瘤细胞H18由我室制备，分泌单抗Hab18，特异性结合肝癌相关抗原Hab18G／CD147分子。为了提高杂交瘤细胞在生物反应器培养中抗体的产量，本实验欲从抗凋亡及细胞增殖抑制两方面着手研究，以求提高杂交瘤细胞分泌抗体的产量，并整合上述因素，在5L生物反应器中进行中试培养。 第一部分 鼠bcl-X_L基因的克隆及在CHO细胞中的表达 用Trizol提取BALB／c小鼠脑组织总RNA，反转录PCR扩增鼠bct-X_L全长cDNA序列，并将所克隆的序列与pGEMT载体连接，进行测序；为了快速检测所获的bcl-X_L全长cDNA序列是否能完全表达，将其与pEGFP载体连接，构建pEGFP—bcl-X_L重组融合表达质粒；用脂质体法将重组真核表达载体pEGFP-bcl-X_L转染入CHO细胞，用荧光显微镜检测转染细胞中Bcl-X_L-EGFP融合蛋第四零医大学博士论灸白的表达结果表明:成功获得了鼠bcl一cDNA，构建编码鼠bcl-Xl的真核融合表达载体pEGFP一be卜XL，转染CHO细胞后观察到融合蛋白表达结论鼠bcl气XL基因的克隆及融合表达，为进一步在高密度、大规模细胞培养中利用bcl一具有重要意义。 第二部分H18杂交瘤细胞株抗凋亡能力的改造及鉴定 利用PCR从pGEM一T-be卜XL质粒中获得bcl一基因，构建真核表达载体pEF一bel一XL，脂质体法转染杂交瘤细胞H 18，G418筛选稳定表达株，Westem blotting检测目的蛋白表达，流式细胞仪检测Bd一XL提高杂交瘤抗正丁酸钠(NaBu)诱导凋亡的功能将构建的编码鼠bcl一基因的真核表达载体pEF一bcl一XL，转染H18细胞后，获得稳定的表达株细胞;稳定表达Bcl一XL的细胞具有抗正丁酸钠诱导凋亡的功能鼠bcl、k飞基因在杂交瘤细胞中稳定表达，提高了杂交瘤抗凋亡的能力，对高密度大规模培养杂交瘤细胞具有重要意义。 第三部分NaBu促进HIS.D4杂交瘤分泌抗体机制的研究 利用NaBu促进杂交瘤细胞分泌单克隆抗体，并对其作用机制进行了研究结果表明在H18D4杂交瘤细胞对数生长后期添加0.6mM浓度的NaBu与对照相比可提高抗体的产量1 .5倍;流式细胞仪检测细胞周期表明此时83.7%的细胞处于GI期;免疫印记结果显示在有NaBu作用下杂交瘤细胞P27蛋白表达显著升高因此，NaBu可通过促进P27蛋白的表达，抑制杂交瘤细胞的增殖，从而提高杂交瘤细胞分泌抗体的能力对NaBu进一步在高密度大规模培养杂交瘤细胞中的应用具有重要意义。第四零医大学博士论丈 第四部分H18.D4杂交瘤细胞的中试研究 利用SL生物反应器悬浮手睡忆培养改造后的抗凋亡杂交瘤细胞H18.D4，并结合细胞增殖抑制策略，研究其中试培养特点及生产的抗体特性H18.D4杂交瘤细胞2xl护个/mIJ接种于SL生物反应器中，当细胞生长到对数生长后期加入0.6mM NaBu，培养结束后通过Streamhne SP纯化系统回收纯化培养上清中的目标抗体;利用流式细胞仪Biacore和免疫组织化学对纯化的抗体进行免疫学鉴定;结果显示抗凋亡杂交瘤细胞H18.D4可快速的达到对数生长，细胞比生长速率为12h，加入NaBu后细胞的生长受到抑制，最高细胞密度为2.5 x 106个/mL;有效细胞培养周期可持续5天;抗体浓度为196ug/mL，收获培养上清后经Streamline sp和阴离子层析柱纯化后，抗体纯度可达95%，抗体免疫活性经鉴定可特异性的与肝癌细胞HHCC及肝癌组织的结合，经此生产过程获得的抗体的亲和常数为6.17x10一’。M抗凋亡杂交瘤细胞H18.D4结合增殖抑制药物NaBu在SL生物反应器中培养，其抗体产量与单纯杂交瘤细胞H18培养相比可提高2.5倍，而且最终获得的抗体与鼠腹水制备的抗体的免疫活性相同。