PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted in chromosome 10,PTEN)又名MMACl、TGF-B或TEPl,是1997年发现定位于第10号染色体(10q23.3)上的一种抑癌基因,也是人类迄今所发现的唯一在体内同时具有蛋白磷酸酶活性和脂质磷酸酶活性的抑癌基因。在前列腺癌、乳腺癌、散发的恶性胶质细胞瘤等多种肿瘤中都有很高的删除性突变率。PTEN蛋白由403个氨基酸残基组成,其N-末端含有磷酸酶结构域,C-末端具有蛋白PDZ结构域结合序列;PTEN作为一种蛋白磷酸酶,可以使三磷酸肌醇降解,因此PTEN是一个很有效的PI3K-Akt通路的负性调节因子,可参与调节胰岛素组织的信号传导。同时,PTEN可调控哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin,m TOR)的活性,参与调节细胞自噬。本文就PTEN在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)相关胰岛素抵抗中的作用以及PTEN调控自噬活性对登革病毒(dengue virus,DENV)感染性的影响作一探讨,为深入理解HCV和DENV的致病机制和防治措施提供实验依据。(一)PTEN参与HCV相关胰岛素抵抗及其机制研究HCV是一种主要经过血液传播的嗜肝性病毒,据世界卫生组织统计,全球HCV感染者约1.8亿。HCV基因组具有高变异性和多种宿主免疫逃避机制使得机体难以有效清除病毒,致使约50-80%感染者发展为慢性丙型肝炎,其中20-30%将发展成肝硬化。在肝硬化患者中每年有1-4%演变为肝细胞癌(hepatacellular carcinoma,HCC)。虽然聚乙二醇干扰素联合利巴韦林,外加最新的直接抗病毒药物的三联治疗方案可大大提高HCV感染的持续病毒学应答反应,但仍面临着治疗费用昂贵,治疗时程长,副作用多等诸多问题,尚无有效疫苗问世。HCV的慢性感染可导致肝脏慢性炎症、坏死及纤维化,部分患者可发展为肝硬化甚至肝癌。有研究表明,慢性丙型肝炎患者大约有25-50%存在着不同程度的糖脂代谢异常。HCV感染者发展成为胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)及2型糖尿病(type2 diabetes mellitus,T2DM)的危险性越来越高。慢性HCV感染与IR紧密相关,互相促进导致恶性循环,使这部分患者成为临床上难治的丙型肝炎。同时,IR是肝脂肪变性、肝硬化发展的中心环节,更是HCV感染所致肝癌发展过程中的一个独立预测因素。PTEN是一种特异性蛋白酪氨酸磷酸酶,主要催化三磷酸肌醇PIP3的降解,PIP3是磷酸肌醇激酶PI3K的产物,可通过激活下游的Akt传递胰岛素信号,是胰岛素代谢通路的重要信号因子,促进葡萄糖转运子-4(glucose transporter-4,GLUT-4)对葡萄糖的转运。在3T3-L1脂肪细胞中,内源性PTEN的作用是削弱胰岛素对葡萄糖的激动作用,引起脂肪细胞的胰岛素抵抗。在骨骼肌细胞中,也发现PTEN可阻断胰岛素信号通路,产生胰岛素抵抗。在HCV感染所导致的肝癌中,PTEN功能降低,同时PTEN可通过下调PI3K/Akt信号通路参与胰岛素抵抗的发生发展。本研究中,我们发现HCV感染可促进胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)Ser307的磷酸化,加快IRS-1降解,进而负反馈抑制胰岛素信号通路IRS-1/PI3K/Akt。进一步研究发现,HCV感染可降低肝癌细胞系Huh7.5.1对外源胰岛素刺激的敏感性,经胰岛素刺激后,HCV感染组中p Akt Ser473和p GSK3βSer9水平均明显减弱。为探讨PI3K/Akt信号通路中重要的负调控分子—PTEN是否参与了HCV相关胰岛素抵抗的发生,我们检测了不同感染复数(M.O.I=1,2,3)的HCVcc感染细胞后PTEN的表达情况。结果发现,HCV感染可明显降低PTEN的m RNA和蛋白表达水平。进一步研究发现,PTEN过表达可下调p IRS-1Ser307水平,减缓IRS-1的降解。而在PTEN敲低组中,p IRS-1Ser307的表达水平明显升高,IRS-1的水平明显降低。以上结果提示HCV 2a感染所引起的p IRS-1Ser307的上调和IRS-1的下调可能是PTEN依赖的。通过构建p JFH1-core质粒并转染Huh7.5.1细胞,我们发现HCV核心蛋白可引起PTEN水平下调,同时p IRS-1Ser307表达升高和IRS-1的降解,提示HCV 2a核心蛋白可下调PTEN表达,同时上调p IRS-1Ser307的表达,进一步促进胰岛素信号关键分子IRS-1的降解,从而参与胰岛素抵抗的发生。本部分研究了抑癌基因PTEN与细胞胰岛素信号通路稳态的关系,进一步探索PTEN是否参与HCV相关胰岛素抵抗的发生,及HCV核心蛋白对PTEN及细胞胰岛素信号通路稳态的影响,为研究HCV与胰岛素抵抗之间相互作用提供了新的思路和治疗靶点。(二)PTEN通过下调自噬活性抑制登革病毒感染登革病毒(dengue virus,DENV)属于黄病毒属,为单正链RNA病毒,登革病毒感染常引起自限性登革热(dengue fever,DF),严重者发展为登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克综合征(dengue shock syndrome,DSS)。近年来,随着地球变暖和人口流动增加,登革病毒感染呈暴发流行趋势,已成为一个严重的公共卫生问题。迄今,尚无特异性治疗药物和有效的疫苗。因此,登革病毒感染的致病机制及其防治问题仍亟待解决。细胞自噬是真核细胞通过溶酶体途径降解胞内自身成份的过程,对维持细胞内环境稳定具有重要作用。越来越多的研究表明,自噬与病原体感染关系密切,如某些病毒可通过其编码蛋白抑制细胞自噬,从而逃避自噬的清除作用;而包括登革病毒在内的一些单正链RNA病毒却利用自噬泡作为复制位点,通过诱导自噬来促进病毒增殖。作为m TOR信号通路的重要负调控分子,PTEN亦参与细胞对自噬的调控。然而,它是否参与登革病毒感染细胞中自噬活性的调节目前并不清楚。因此,本研究探讨了登革病毒2型(DENV-2)感染人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)后,PTEN对感染细胞自噬活性的影响及其可能的作用机制。首先,我们用不同感染复数(M.O.I=0.1,0.5,1)的DENV感染HUVEC细胞48 h后,Western-blot法检测细胞自噬标志分子——微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)中LC3II/LC3I比值的变化。结果显示,随着病毒感染复数的增大,LC3II/LC3I比值增加,P62蛋白的特异性降解增加,说明DENV可诱导感染细胞发生自噬,自噬活性与病毒感染量呈正相关。然后,我们采用Western-blot和实时荧光定量PCR法分别检测了细胞自噬的重要调控蛋白——PTEN在DENV感染细胞中的表达水平和m RNA含量情况。结果显示,PTEN的蛋白表达和m RNA水平均降低,且随着病毒感染复数的增大,下降程度越显著。为进一步明确PTEN对登革病毒感染及细胞自噬的可能作用机制,我们构建了p Lenti-PTEN和p Lenti-sh PTEN慢病毒表达质粒,借助于慢病毒包装与感染系统,过表达或敲低HUVEC细胞中的PTEN;该细胞经感染DENV后,分别用Western-blot和实时荧光定量PCR法检测细胞中DENV capsid蛋白表达情况和m RNA含量,间接免疫荧光法检测释放到细胞培养上清中的子代病毒颗粒的滴度。结果显示,过表达的PTEN能显著提高LC3II/LC3I的比值,促进DENV复制和子代病毒颗粒的释放。反之,PTEN被敲低后,细胞自噬活性受到抑制,即LC3II/LC3I比值下降,从而使细胞中的DENV复制和培养上清中的子代病毒颗粒含量均显著减少,说明PTEN可能通过促进细胞自噬而促进DENV的生命周期。本研究结果说明,DENV感染HUVEC细胞所诱导的PTEN蛋白表达下调极可能是宿主细胞本身针对病毒感染的一种保护性应答反应。本研究结果为深入探讨登革病毒与宿主细胞相互作用奠定了理论基础,也为登革病毒感染的防治策略提供了新思路。