mRNA可变剪接在肿瘤发生发展中发挥着重要作用,其功能的失调与肿瘤的发生发展息息相关;mRNA可变剪接在肿瘤演变过程中发挥着举足轻重的作用,很大程度上影响临床患者预后及治疗疗效等,但关于mRNA可变剪接在肿瘤演变过程中机制至今仍未完全阐明。BUD31首次被报道在酵母菌的内含子剪接及mRNA成熟中发挥作用,其功能障碍导致酵母菌特定基因的mRNA成熟受损和基因表达下降,影响着酵母菌的发芽增值和细胞形态。另一篇文献报道BUD31在c-MYC基因驱动的乳腺癌细胞系中通过内含子剪接调控着多个基因表达水平,c-MYC基因激活导致转录水平的上调依赖着剪接体的功能;剪接体成分之一,BUD31功能抑制导致了多个基因功表达水平下降,并增加了 c-MYC基因敲降的细胞合成致死性,这提示BUD31在真核细胞中通过内含子剪接调控基因网络进而发挥重要作用。根据我们前期实验结果,我们发现和正常组织相比,BUD31在肿瘤组织中出现上调表达,这提示BUD31可能在肿瘤演变过程中发挥着重要作用,其作用机制可能也是介导于mRNA剪接体。鉴于mRNA内含子剪接和mRNA可变剪接存在功能的相似性和广泛的交集性,因此我们提出假设BUD31可能不仅仅通过内含子剪接作用机制调控肿瘤基因,也可能通过mRNA可变剪接或两种作用机制同时存在以调控肿瘤基因网络进而促进肿瘤特性发生。本文重点探究BUD31通过mRNA可变剪接或mRNA内含子剪接联合mRNA可变剪接调控肿瘤基因以促进肿瘤发生。首先,我们通过本实验94对食管鳞癌RNA-seq和TCGA食管癌RNA-seq数据进行BUD31 mRNA表达水平分析,结果提示和正常组织相比,食管癌肿瘤组织中BUD31基因表达水平呈现显著上调,随后我们通过TCGA泛癌RNA-seq数据进行分析,结果提示和正常组织相比,BUD31在多个肿瘤组织中呈现显著上调表达,如头颈鳞癌、肺癌、肝癌及乳腺癌。同时,我们也进行BUD31基因表达水平和肿瘤患者临床预后进行生存分析,结果提示在多个肿瘤中,BUD31基因表达水平和患者总生存期呈现显著相关,如头颈鳞癌、恶性胶质瘤、子宫内膜癌,高表达BUD31基因水平的患者临床预后更差,这些结果提示BUD31可能在肿瘤癌特性中发挥着重要作用。接下来,我们通过细胞表型实验证实,BUD31基因的敲降导致了肿瘤细胞恶性表型的降低,如细胞增殖、细胞迁移和细胞侵袭及细胞克隆形成;反之BUD31基因的过表达导致了肿瘤细胞恶性表型的增加。鉴于BUD31基因在多个肿瘤中出现异常上调表达,如食管癌和乳腺癌,BUD31在肿瘤中作用机制具有广泛性,因此我们下载了已公开发表在乳腺癌中BUD31瞬时敲降的RNA-seq数据,进行了基因差异表达分析,共获得750个上调表达基因和940个下调表达基因,随后分别在本实验室94对食管鳞癌RNA-seq数据和TCGA食管癌RNA-seq数据中对以上基因进行基因相关分析,分别获得113个基因和242个基因（其中81个基因为两个数据集所共有）,并找出两个数据集正相关和负相关前10位的基因,其中包括MCM7和CPSF4基因。鉴于MCM7和CPSF4基因在肿瘤中发挥着癌基因作用,二者同时具有多个mRNA转录本及多个蛋白异构体,因此我们选择MCM7和CPSF4两个基因作为典型,以探究BUD31通过mRNA可变剪接或同时通过mRNA可变剪接和内含子剪接发挥着癌基因作用以促进肿瘤发生。为了确认BUD31通过内含子剪接调控基因表达水平,我们瞬时敲降了BUD31基因表达水平,qRT-PCR检测结果提示BUD31表达水平下降导致了多个基因内含子保留率上升和基因表达水平下降,这也和之前文献报道一致。令人惊讶的,我们通过qRT-PCR和WB实验证实,BUD31基因表达水平下降导致MCM7转录本1和MCM7转录本2比例失调及后续MCM7蛋白异构体1和MCM7蛋白异构体2比例失调;反之BUD31基因过表达导致了相反的MCM7 mRNA和蛋白变化情况。接下来我们也在CPSF4基因进行了验证,也取得类似的实验结果。以上结果首次证实BUD31存在mRNA可变剪接作用机制,并通过mRNA可变剪接和mRNA内含子剪接同时调控基因表达水平以促进肿瘤发生。此外,我们还发现了BUD31调控着两个经典癌基因,PIK3CA和c-MYC基因的表达水平,但未检测到这两个基因的内含子保留率显著变化,这可能与CPSF4和MCM7表达水平上升有关。我们通过MCM7和CPSF4基因敲降实验证实了 MCM7和CPSF4在肿瘤发挥着癌基因作用,此外我们在食管肿瘤组织中发现,和正常组织相,肿瘤组织中MCM7蛋白异构1为主要表达形式出现了显著上调表达,而MCM7蛋白异构体2变化不明显。在细胞系中也得到类似的实验结果,这提示MCM7蛋白异构体1发挥着促肿瘤特性作用,这也和BUD31通过上调MCM7蛋白异构体1进而发挥促癌作用一致。为了进一步确认BUD31基因作用机制具有广泛的肿瘤特性,我们选择了其他肿瘤细胞系进行了验证,实验结果和在食管癌细胞结果完全一致,这提示BUD31基因作用机制具有广泛肿瘤特性。综上所述,我们首次发现了BUD31在肿瘤特性中功能作用新机制,即BUD31通过mRNA可变剪接调控着MCM7和CPSF4转录本及蛋白异构体比例变化,发挥促癌作用,并证实BUD31基因通过mRNA内含子剪接和mRNA可变剪接分别调控MCM7和CPSF4表达水平和转录比例变化共同发挥促癌作用。此外,我们通过多种肿瘤细胞系进行了验证,表明BUD31基因的作用机制具有广泛的肿瘤特性,这提示BUD31基因是一个潜在的肿瘤治疗靶基因和广泛肿瘤应用价值,同时也突出了 mRNA可变剪接在肿瘤特性的重要作用。在目前的肿瘤免疫治疗中,以PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂为代表免疫治疗取得一定的治疗效果;但其肿瘤客观有效率仅约40%,部分肿瘤患者对PD-1/PD-L1阻断剂应答不佳,疗效欠佳。部分患者肿瘤组织检测到肿瘤浸润淋巴细胞聚集,但未检测到肿瘤组织PD-L1的表达,这提示肿瘤组织可能通过非PD-1/PD-L1通路负向调控肿瘤免疫,借助于非PD-1/PD-L1肿瘤免疫检查点负向调控肿瘤免疫,进而影响肿瘤微环境,逃避免疫细胞的杀伤。因此,寻找新的免疫检查点对PD-1/PD-L1免疫检查点阻断剂疗效欠佳及开发新的肿瘤免疫手段至关重要。本课题尝试寻找新的肿瘤免疫检查点以探究新的肿瘤免疫负向调控机制和阐述肿瘤免疫微环境。首先,我们根据对本实验94对食管鳞癌RNA-seq数据和TCGA数据进行基因差异表达分析,结果提示和正常组织相比,肿瘤组织中LAMP3（lysosomal associated membraneprotein3,溶酶体相关膜蛋白3）,LAMP家族蛋白的一个成员,表达水平出现显著上调。LAMP3被报道在树突状细胞成熟过程表达,提示LAMP3可能参与正常免疫的调控机制,尤其负向调控免疫反应以防止免疫过激反应。随后我们查询了 HPA数据库中LAMP3数据,结果提示LAMP3极少表达于正常组织中,除了肺脏、阑尾和睾丸;LAMP3广泛表达于免疫细胞不同类型和多种肿瘤组织中,这提示LAMP3可能在免疫细胞和肿瘤细胞中发挥着类型的免疫调控机制,LAMP3参与的免疫调控机制可能广泛存在与免疫系统和肿瘤组织中。此外,我们对TCGA泛癌RNA-seq数据进行基因表达分析,结果提示和正常组织相比,肿瘤组织中LAMP3呈现显著上调表达,如乳腺癌、结肠癌、胃癌和头颈鳞癌。随后进行了生存相关分析,结果提示肿瘤组织中LAMP3表达水平和患者总生存期相关,高表达LAMP3的患者总生存期更短,如乳腺癌、子宫内膜癌和肾癌,这表明LAMP3可能通过肿瘤免疫调控机制在肿瘤特性中发挥着重要作用,并影响着临床预后。接下来,我们进一步对本实验食管鳞癌RNA-seq和TCGA食管癌RNA-seq进行基因表达水平相关性分析,结果均提示肿瘤组织中LAMP3表达水平和多种免疫标志基因表达水平存在显著相关,如CD3E、GZMA、GZMB、GNLY、PRF-1、IFNG等。此外,我们在TCGA乳腺癌和黑色素瘤RNA-seq也进行了基因表达水平相关性分析,结果和食管癌中情况一致,这表明肿瘤组织中LAMP3和免疫功能存在显著相关,可能广泛参与肿瘤免疫调控。本文进一步对LAMP3表达水平和PD-L1表达水平进行相关分析,结果提示LAMP3和PD-L1表达水平不存在相关性,肿瘤组织中同时出现LAMP3和PD-L1高表达的比例约5%,蛋白质BLAST也提示二者不具有任蛋白质相似性或同源性,这提示LAMP3可能通过和PD-L1完全不同的调控机制对肿瘤免疫进行调控。GZMA、GZMB、GNLY和IFNG均出现显著上升,这提示在肿瘤组织中,免疫标志基因表达水平出现了增强,而肿瘤并未得到有效控制,提示肿瘤中出现其他免疫负向调控机制进而导致肿瘤免疫逃逸。最后,本文对本实验64例食管癌组织单细胞数据进行相关分析,结果提示表达CD3e的T淋巴细胞和肿瘤上皮细胞上LAMP3阳性比例呈现显著正相关,效应性T细胞的IL-2水平和肿瘤上皮上LAMP3表达水平呈现显著负相关,这提示LAMP3可能直接参与了肿瘤免疫负向调控。根据实验室数据分析结果提示,肿瘤组织中LAMP3可能参与肿瘤免疫负向调控,进而引起了肿瘤免疫逃逸现象。首先,我们对肿瘤细胞系进行验证发现LAMP3广泛表达于多种肿瘤细胞系和正常细胞系中,这提示LAMP3广泛表达于肿瘤细胞中。接下来,我们通过细胞免疫实验探究LAMP3蛋白是否表达于肿瘤细膜上,结果提示LAMP3蛋白除了表达于肿瘤细胞细胞质内,还表达于肿瘤细胞细胞膜上,这提示肿瘤细胞可能通过细胞膜上LAMP3进行肿瘤免疫负向调控,这为后续的免疫功能实验提供了关键的实验依据。我们成功构建了 KYSE450 LAMP3稳定敲降和稳定过表达细胞系。细胞表型结果实验提示肿瘤细胞LAMP3对细胞增殖无显著影响,但对细胞迁移和细胞侵袭有显著影响,这提示肿瘤细胞通过转移和侵袭发挥肿瘤特性作用。随后T淋巴细胞杀伤实验证实,和对照组相比,LAMP3稳定敲降细胞系对T淋巴细胞杀伤更为敏感;和对照组相比,LAMP3稳定过表达细胞系对T淋巴细胞杀伤不敏感,T淋巴细胞对LAMP3稳定过表达细胞系具有较差的杀伤效果,这提示提示肿瘤细胞LAMP3降低了 T淋巴细胞杀伤能力。免疫细胞和肿瘤细胞共培养实验结果提示,对照组相比,LAMP3稳定敲降组中PBMC多个免疫标志基因表达水平出现显著上升,如GZMA、GZMB、GNLY、PRF-1、IFNG,这提示肿瘤细胞LAMP3负向调控T淋巴细胞免疫功能。此外,我们还发现和对照组相比,LAMP3稳定敲降组中T淋巴细胞功能出现增强时,LAMP3表达水平也出现了显著上升,这也和之前文献报道LAMP3显著上调表达在激活的T淋巴细胞上完全一致,这提示T淋巴细胞的LAMP3表达可能直接负向调控T淋巴细胞功能,是一个全新的潜在免疫检查点。综上所述,肿瘤组织中LAMP3表达水平出现广泛上调,并和患者预后显著相关。肿瘤细胞LAMP3对细胞迁移和细胞转移有显著影响,但对细胞增殖和细胞克隆形成无显著影响。肿瘤细胞LAMP3直接负向调控T淋巴细胞功能,结合LAMP3显著上调表达于激活的T淋巴细胞,表明LAMP3是一个新的肿瘤免疫负向调控分子,很可能是全新的免疫检查点。