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背景:结核病（Tuberculosis,TB）由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,MTB）感染引起。据估计,全球约1/4的人感染MTB,包括活动性结核病（Activetuberculosis,ATB）和潜伏性结核感染（Latenttuberculosis infection,LTBI）。中国普通人群中约20%为LTBI,其一生中约5%-10%的可能进展为ATB。因此,快速准确地鉴别ATB和LTBI,以达到精准治疗,对降低结核病的发病率至关重要。目前结核病诊断困难,能否通过增加新的抗原,或检测多种的细胞因子鉴别ATB和LTBI,具有重要的临床意义。研究目的:本研究拟通过荧光免疫斑点法（FluoroSpot）检测经MTB潜伏相关抗原Rv1733c、Rv1733c SLP和MTB特异性抗原ESAT-6、CFP-10刺激后分泌的特异性T细胞频数和比例,评价MTB抗原特异性细胞免疫反应鉴别ATB和LTBI的准确性。研究方法:本研究分两部分,均为病例对照研究。第一部分纳入2017年1至12月北京协和医院和北京胸科医院门诊和住院的病原学确诊ATB患者为病例组,LTBI为对照组。Fluorospot检测MTB潜伏相关抗原Rv1733c和Rv1733c SLP刺激下IFN-γ/IL-2的分泌,评价鉴别ATB与LTBI的准确性。第二部分纳入2020年4月至2021年4月北京协和医院和北京胸科医院门诊和住院的病原学确诊和临床诊断的ATB患者为病例组,LTBI和未感染者为对照组,Fluorospot检测经MTB特异性抗原ESAT-6和CFP-10刺激下特异性T细胞IFN-γ/IL-2/TNF-α的分泌,评价鉴别ATB与LTBI的准确性。研究结果:第一部分纳入ATB患者57例,LTBI患者36例。以Rv1733c SLP刺激下产生的单分泌IL-2的T细胞频数绘制ROC曲线,AUROC最大为0.766（95CI 0.662-0.870）,界值为 1（SFCs/2.5×105 PBMCs）时,鉴别 ATB 和 LTBI 的灵敏度为 72.2%（95CI 54.8%-85.8%）,特异度为和 73.7%（95CI 60.3%-84.5%）。ESAT-6&CFP-10-FluoroSpot 检测单分泌IFN-γ的T细胞频数和比例,鉴别诊断ATB和LTBI的灵敏度和特异度分别为 82.5%（95CI 70.1%-91.3%）和 66.7%（95CI 49.0%-81.4%）。在 ESAT-6&CFP-10-FluoroSpot的基础上,联合Rv1733c SLP刺激后单分泌IL-2的T细胞频数,可提高灵敏度至 84.2%（95CI 72.1%-92.5%）,特异度提高至 83.3%（95CI 67.2%-93.4%）。第二部分共纳入病原和临床诊断ATB患者50例、LTBI者87例,未感染者71例。FluoroSpot（IFN-γ/IL-2/TNF-α）和 T-SPOT.TB检测MTB 特异性抗原（ESAT-6/CFP-10）刺激下总分泌IFN-γ的T细胞频数之间有显著相关性（p<0.0001）。以FluoroSpot检测经ESAT-6&CFP-10刺激下产生的分泌IFN-γ+或IL-2+的任一阳性T细胞频数绘制ROC曲线,AUROC 最大为 0.980（95CI 0.963-1.003）,界值为 7（SFCs/2.5×105 PBMCs）时,鉴别ATB和未感染者的灵敏度为100%,特异度为87.3%。在50例ATB的患者中,T-SPOT.TB阳性率为82%,FluoroSpot可提高至90%。在病原确诊25例ATB患者中,T-SPOT.TB 阳性率为92%,FluoroSpot可提高至100%。在临床诊断的25例ATB患者中,T-SPOT.TB 阳性率为 72%,FluoroSpot 可提高至 80%。T-SPOT.TB 鉴别 ATB 和 LTBI的灵敏度和特异度为 48.8%和 85.7%。以 Fluorospot（IFN-γ/IL-2/TNF-α）检测 ESAT-6&CFP-10 刺激下产生的分泌 IFN-γ+/IL-2-/TNF-α-、IFN-γ-/IL-2+/TNF-α-、IFN-γ-/IL-2-/TNF-α+、IFN-γ+/IL-2+/TNF-α-、IFN-γ+/IL-2-/TNF-α+、IFN-γ-/IL-2+/TNF-α+的特异性T细胞频数和比例为自变量进行二分类logistic回归分析并绘制ROC曲线,AUROC为0.858（95CI 0.787-0.929）,鉴别ATB 和 LTBI 的灵敏度和特异度为 76.7%和 84.3%。结论:Rv1733c SLP与ESAT-6&CFP-10联合,有助于辅助鉴别ATB和LTBI。应用Fluorospot（IFN-γ/IL-2/TNF-α）检测结核分枝杆菌特异性抗原多细胞因子应答免疫反应与T-SPOT.TB相比具有更好的鉴别ATB和LTBI的准确性。