除草剂炔草酯降解菌分离鉴定、降解特性及降解机理研究

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炔草酯是一种芳氧苯氧丙酸类除草剂,全球销售额在芳氧苯氧丙酸类除草剂中排名第二。有研究表明炔草酯对哺乳动物有着致畸、致癌的风险。本研究以炔草酯为底物,对炔草酯降解微生物进行分离筛选,以期为炔草酯污染的生物修复提供理论基础和微生物资源支持。
  经过多轮富集驯化,从生产炔草酯的农药厂污水处理系统活性污泥中,成功得到了能够在7 d内完全降解炔草酯的菌群WP。利用UPLC-MS鉴定菌群WP降解炔草酯的中间产物主要有炔草酸、4-(5-氯-3-氟-2-吡啶氧基)苯酚、5-氯-3-氟2-吡啶酮,揭示了炔草酯通过细菌降解的完整代谢途径。
  通过对富集液中细菌进行分离纯化,并利用含有炔草酯的 LB 固体培养基,获得了4个能够降解炔草酯的菌株WP-18、WP-27、WP-38、WP-66。对这4个菌株降解炔草酯的能力进行测定,确定WP-66是一株炔草酯高效降解菌株。经过形态、生理生化试验及16SrRNA基因序列分析,将WP-66鉴定为Pseudoxanthomonas sp.,其最适生长温度和pH分别为37 ℃和8.0。
  菌株WP-66降解炔草酯的最适温度为37 ℃,最适pH为7.0;在此条件下, 5%接种量的菌株WP-66在15 h内可将100 mg·L-1炔草酯降解92.21%。同时在1%低水平接种量及500 mg·L-1高浓度炔草酯的环境中,菌株WP-66也能够很好的发挥降解作用。经UPLC-MS鉴定菌株WP-66降解炔草酯的产物为炔草酸,推测该菌株降解炔草酯的机理是通过其分泌酯酶使炔草酯中酯键断裂来发挥降解作用的。
  通过对菌株WP-66进行全基因组测序并进行基因功能注释,从中找到了5个可能参与炔草酯降解的酯酶基因。以pET29a(+)为载体,成功构建了其中一个酯酶基因est 5的表达载体pET29a-est 5,并将其在E.coli BL21(DE3)中实现了异源表达,表达的酶液能够在含炔草酯的固体平板上水解炔草酯形成透明圈,证明菌株WP-66降解炔草酯的机理是通过其分泌的酯酶来实现的。
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