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研究背景和目的脓毒血症以其高发病率、高病死率严重威胁人类健康,成为全球公共卫生的挑战。脓毒症进展中由于脏器缺血、感染等因素导致脏器损伤。当多器官功能障碍(MODS)出现时,死亡率骤升至56-100%。既往研究发现,心脏作为MODS时重要的受损器官之一,大约50%脓毒症患者可出现心脏功能紊乱,而当出现脓毒症心肌抑制时,病死率可上升至70%。从本质上讲,脓毒症是由感染引发的宿主免疫、炎症和凝血机制的失调,其发病机制非常的复杂,这就决定了单一调控脓毒症发病机制中某一个环节或某一种关键分子的治疗措施效果并不理想。因此,脓毒症心功能障碍的治疗需要从整体上改善宿主体内紊乱的免疫平衡状态,才能有效的减轻脓毒症造成的器官损伤,有效的改善疾病预后,提高生存率。间充质干细胞具有多种生物学效应,包括调节多种免疫细胞活性,抑制炎症级联反应,减少细胞凋亡,促进血管新生,激活体内的原位干细胞等具有多种生物学效应。大量前期研究己发现:间充质干细胞在脓毒症生物治疗方面已崭露头角。然而,细胞治疗的作用机制仍不明确,这就大大限制了治疗的获益及临床转化。课题针对当前脓毒症细胞治疗机制不明确的问题,通过建立LPS腹腔注射诱导脓毒症的小鼠动物模型,在整体水平观察骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs)的治疗作用,通过构建转基因动物模型来观察改变m TORC1-S6k信号通路活性对BMSCs治疗脓毒症疗效的影响,通过体外实验研究m TORC1-S6k信号通路在BMSCs治疗脓毒症过程中的作用机制,明确脓毒症生物治疗的关键分子靶点,以通过机制干预来优化细胞治疗策略。研究方法:构建心肌特异性Raptor敲除及过表达的转基因小鼠;原代分离、培养、鉴定B6-e GFP-Fluc双标转基因小鼠的BMSCs及成纤维细胞(Fb),建立LPS诱导的脓毒症模型,造模成功后分别在腹腔脉注射PBS、Fb或BMSCs,计算96小时内小鼠生存率,超声心动图分别测定造模成功后24、96小时的左室收缩及舒张功能,酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清及心肌组织炎症因子水平,Xenogen Kinetic 100小动物活体成像系统观察BMSCs的的归巢情况,电镜显微镜观察心肌超微结构的变化,苏木精一伊红(HE)染色法观察小鼠脏器组织病理变化,免疫组织化学及免疫荧光染色观察小鼠脏器炎性细胞浸润,Western Blot免疫印迹试验检测组织的蛋白水平。体外实验用Raw264.RAW264.7体外加LPS刺激产生cytomix,分别用来刺激RAPTOR沉默及过表达的H9c2,并与BMSCs共培养,Western Blot检测H9c2的m TOR,p-m TOR、RAPTOR,rictor、p70S6K、p-Akt,TLR-4、NF-κB、caspase-3的蛋白水平。研究结果:1.小动物活体成像系统显示:移植BMSCs后72小时(POD3),细胞的荧光强度由第1日POD1(4.02×105±0.36×105)P·s-1·cm-2·sr-1下降至第3日POD3(5.08×104±1.48×104)P·s-1·cm-2·sr-1,提示大量移植BMSCs在炎症急性期都发生了急性死亡,且各组间未见显著统计学差异。小动物超声结果显示,与PBS组和Fbs组相比,BMSCs治疗可显著提高脓毒症小鼠的左室收缩及舒张功能,差异具有统计学意义(p<0.05);与野生型BMSCs治疗组相比,心肌特异性RAPTOR敲除联合BMSCs治疗可更大程度的保护脓毒症小鼠的心功能(p<0.05),而心肌特异性Raptor过表达联合BMSCs治疗组,小鼠的心功能较差(p<0.05)。log-rank生存曲线分析显示,与PBS组和Fbs组相比,BMSCs治疗可显著提高脓毒症小鼠的生存率,差异具有统计学意义(p<0.05,p<0.05),与野生型BMSCs治疗组相比,心肌特异性RAPTOR敲除联合BMSCs治疗可更大程度的提高脓毒症小鼠的生存率(p<0.05),而心肌特异性RAPTOR过表达联合BMSCs治疗则会降低脓毒症小鼠的生存率(p<0.05);2.Elisa检测显示,与PBS组和Fbs组相比,BMSCs治疗可显著减轻脓毒症小鼠的重要脏器及循环血流中的炎症因子水平,差异具有统计学意义(p<0.05),心肌特异性RAPTOR敲除/过表达均不能显著影响心肌组织炎症因子水平,差异无统计学意义(p>0.05)。3.TUNEL染色显示,与PBS组相比,BMSCs治疗可显著降低脓毒症小鼠心肌的凋亡指数,差异具有统计学意义p<0.05),与野生型BMSCs治疗组相比,心肌特异性RAPTOR敲除联合BMSCs治疗可更大程度的降低脓毒症小鼠的心肌细胞的凋亡指数(p<0.05),而心肌特异性RAPTOR过表达联合BMSCs治疗则会提高脓毒症小鼠心肌细胞凋亡率(p<0.05)。4.Western blot体外实验结果显示:LPS上调了心肌细胞TLR-4以及其下游NF-κB的表达,同时RAPTOR和p70S6K也被活化,Rictor和Akt出现了下调。凋亡相关蛋白caspase-3被上调(p<0.05)。当RAPTOR被敲除时,Rictor和Akt蛋白表达出现上调,TLR-4、NF-κB、Raptor、p70S6K和caspase-3的表达下调了(p<0.05);当RAPTOR敲除联合间充质干细胞治疗时,Rictor和Akt出现更为明显的上调,而TLR-4、NF-κB、Raptor、p70S6K和caspase-3则出现更明显的下调。结论:BMSCs辅助治疗能够提高脓毒症小鼠生存率,减轻脓毒症所致重要脏器的病理损伤,改善脓毒症所致重要脏器的功能,减缓脓毒症所致心脏功能的下降;降低脓毒症所致重要脏器炎性细胞浸润,降低脓毒症血清炎症因子水平,提示BMSCs辅助治疗脓毒症的有效性。证明了Raptor敲除可以增加心肌细胞的抗炎抗凋亡能力,而BMSCs移植联合Raptor敲除可以使心肌细胞的这种抗炎抗凋亡能力更明显的增强,阐明BMSCs对脓毒症小鼠治疗作用的机制可能与其抑制巨噬细胞释放致炎因子(IL-1、IL-6、TNF-α),活化巨噬细胞释放炎症抑制因子(IL-10),并通过活化心肌细胞的m TORC2-Akt信号通路增强心肌细胞存活能力,同时下调m TORC1-p70S6K信号通路增强心肌细胞的抗炎抗凋亡能力有关。本研究明确了BMSCs治疗脓毒症的有效性和可能存在的分子靶点,为解决临床上脓毒血症心功能障碍致死率高且无特异性疗法这一问题提供了新思路,为优化BMSCs作为种子细胞的疗效及安全性提供了研究基础,为实现干细胞治疗的临床转化提供了理论依据。