肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种世界范围内常见的恶性肿瘤,每年约650,000人死于HCC,且其发病率有增高的趋势。HCC的转移是其治疗失败、致死率高的主要原因。目前,HCC转移的分子机制仍不甚明确,尚无可用于HCC转移复发临床检测的生物标志物和有效的治疗靶标,对HCC转移关键蛋白的发掘仍然十分迫切和必要。HCC的转移过程与肿瘤细胞的黏附运动、细胞增殖、细胞外基质、机体免疫、肿瘤血管生成等多因素有关。蛋白质组学作为一种全局性、高通量的蛋白质分析策略,是多基因、多因素复杂病理机制研究的有效手段,不仅有助于对疾病机理的阐述,还有利于发现新的疾病标志物和药物靶标。定量蛋白质组学的提出标志蛋白质组研究已从静态的定性分析过渡到动态变化的定量研究上来。细胞培养条件下稳定同位素标记(stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC)技术是一种国际认可的基于质谱的定量分析技术,其原理是通过在培养集中加入同位素型氨基酸(如13C6-Lysine、13C6-Argine),使得胞内蛋白被稳定标记,根据一级质谱图中轻、重同位素峰的面积进行相对定量。该技术具有样本需求量少、兼容疏水性蛋白和偏碱性蛋白、定量准确等优点,由于在细胞培养阶段已完成同位素的掺入性标记,其标记效率不受后续处理步骤的影响,因此SILAC技术不仅适合于进行全细胞蛋白的分析,还适合于需使用特殊裂解液的膜蛋白的鉴定和定量。为了进一步了解HCC转移的机理,提供候选的诊断标志物和治疗靶标,我们采用SILAC技术进行了高、低转移能力HCC细胞蛋白质组的定量分析。采用LTQ-FT质谱共鉴定到2,335个蛋白质,其中91个蛋白质在高转移HCC细胞中表达上调,61个蛋白质表达下调。通过定位分析,发现细胞质膜、线粒体和细胞核蛋白发生了明显变化,说明在亚细胞水平进行深入研究具有重要意义。功能分析表明高转移HCC细胞内许多参与黏附运动、脂类合成的蛋白质表达上调,而负责电子传递的蛋白质表达下调,导致HCC细胞迁移能力的增强、氧化磷酸化水平的降低以及胞内脂类的聚集。除了许多变化趋势与文献报道一致的蛋白质外,我们还发现多配体聚糖结合蛋白-1、分泌粘腺蛋白XAG-2、雌二醇17β脱氢酶12、溶质转运家族12成员2等在高转移HCC细胞中表达上调,维甲酸结合蛋白2、血红素过氧化物酶1、SUMO2蛋白、雌二醇17β脱氢酶2等表达下调。采用免疫印迹技术,进一步对其中的六个差异蛋白质进行了验证,其结果与SILAC定量值一致。其中,溶质转运家族12成员2和蛋白质二硫键异构酶4还在临床病人血清中进行了初步的确认,提示它们有可能成为检测HCC转移的生物标志物,具有一定的临床应用潜能。质膜作为细胞的表面结构,在细胞的黏附、运动、信号传导、物质运输等方面发挥重要的功能。质膜蛋白在肿瘤细胞从原发瘤部位脱落、细胞迁移运动、黏附并穿过血管着床于靶器官、与靶器官组织相互作用等多个环节中发挥重要作用,与肿瘤的转移密切相关。目前已发现的药物靶标大部分定位于细胞质膜,许多与肿瘤发生发展相关的质膜蛋白可作为重要的药物靶标。此外,部分质膜蛋白可从细胞表面脱落进入体液,成为潜在的生物标志物,如检测消化道肿瘤的癌胚抗原。尽管质膜蛋白的研究具有重要意义,但它的分离一直是难点。我们采用硅胶包被法分离质膜,阳离子硅胶通过静电作用结合于细胞外表面,使质膜密度增大,匀浆破碎细胞后通过密度梯度离心收集质膜沉淀。共进行了四次重复试验,通过透射电镜、免疫印迹和蛋白质得率对质膜富集程度、提取效率进行评价,发现该方法内膜系统污染少,质膜富集效果明显。我们将硅胶包被技术与SILAC技术相结合,进行高、低转移HCC细胞质膜蛋白的定量分析,通过亚细胞的分级,降低样品的复杂度,有利于低丰度质膜蛋白的鉴定和定量。采用LTQ-FT质谱共鉴定到1,268个蛋白质,其中55个蛋白质在高转移HCC细胞中表达上调,136个蛋白质表达下调。根据GO、IPA和Uniprot的注释,所有被鉴定蛋白质中257个具有质膜定位;其它在数据库中没有质膜定位信息的蛋白质中,部分蛋白质如组蛋白、热休克蛋白和蛋白质二硫化物异构酶有质膜定位的文献报道,有待于深入研究。质膜定位的差异蛋白有42个,大部分与物质运输和信号传导相关,并且许多细胞黏附分子和细胞骨架相关蛋白表达上调。其中,多药抗药性相关蛋白1、3的表达上调可能与肿瘤细胞的药物敏感性降低相关;参与钠离子重吸收的碳酸氢钠协同转运蛋白和溶质转运家族12成员2都表达上调,钠离子运输蛋白与细胞的伸展、纵深运动、趋电、侵袭、胞外分泌等密切相关,其表达上调可促进肿瘤的转移;负调节TGF-β1信号通路的CD109表达上调,可能与肿瘤细胞的高增殖能力有关。我们采用免疫印迹技术对四个未被报道与HCC转移相关的蛋白质——溶质转运家族12成员2、CD109、丝氨酸化的富含丙氨酸的C激酶底物和突触融合蛋白4进行了免疫印迹验证,结果与SILAC定量值一致。其中蛋白溶质转运家族12成员2在全细胞蛋白实验部分中也得到证实,它在高转移HCC病人血清中表达上调,可作为候选的HCC转移的生物标志物进一步深入研究。对高、低转移细胞株全细胞、质膜和分泌蛋白的定量信息的总体分析提示肿瘤细胞黏附运动能力的增强、线粒体的受损、p53活性的抑制、Na+离子的重吸收、脂类合成的增强、增殖水平的提高、基质金属蛋白酶的合成和运输的增强、抗药性的提高可能与HCC的转移相关。本课题采用SILAC技术对高、低转移HCC细胞的蛋白质组(全细胞蛋白、质膜蛋白)进行定量分析,得到大量的差异蛋白信息,为HCC转移机制的揭示提供了有力帮助,并寻找到两个潜在的HCC转移的生物标志物,具有一定的临床应用前景。