研究背景与目的在世界范围内,乳腺癌公认是最为常见的女性恶性肿瘤。在东亚地区,女性人群中乳腺癌的发生率仅次于胃癌。更甚于在中国部分地区,其发生率以每年3-4%的速度递增,这个水平远远高于世界增长水平,其现状令人堪忧。乳腺癌患者除了以乳腺肿块为主诉进行就医以外,乳头溢液成为另一个不可忽视的乳腺癌临床症状。而且有文献报道,除乳腺肿块和乳房疼痛这两大常见主诉,乳腺相关科室大约有5%的患者因乳头溢液前来医疗问询。目前临床需要一种高效的诊断工具来辅助乳腺导管造影术和乳头溢液脱落细胞学检查,对乳头溢液进行检测来筛查良恶性乳腺疾病。乳头溢液中所包含的众多成分就可以作为临床检测的一个契机,以此来对乳头溢液的良恶性进行初步诊断。乳头溢液中肿瘤标记物的水平可以辅助诊断不同乳腺疾病。目前临床上常用的与癌症相关的血清肿瘤标记物为癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原153(CA153)、癌相关抗原125(CA125)、癌相关抗原199(CA199)、癌相关抗原724(CA724)和甲胎蛋白(AFP),以上肿瘤标记物均为糖蛋白,在癌症发展过程中改变其多糖链结构,从而导致相应肿瘤标记物的水平升高。前期文献报道乳腺癌患者血清中CEA水平较高,是一种不良预后的信号并且和癌症的进展期相关。另外也有相关文献得出结论,CEA对于乳腺癌患者的术后随访、复发的早期诊断以及对术后辅助治疗的反应均有意义。与CEA相似,高水平表达的CA153在肿瘤发生发展以及转移过程中起到重要作用。CA153还是癌症复发的独立预测因素以及对晚期乳腺癌患者的重要预后指标。另Lakshmanan I研究表明CA125在乳腺癌组织中表达上调,并且在无瘤乳腺导管内不表达。CA 199与多种恶性肿瘤的侵袭和转移也有密切关系。另有文献称在乳腺癌患者血清中可以检测到高水平CA199。文献报道AFP也是乳腺癌发生的一种危险因素。在乳腺癌患者血清中可以检测到高水平AFP。有前期文献表明,CA724联合CEA、CA199能够提高检测的灵敏度。miRNAs是一种微小的、非编码的单链RNA,是由18到22个核苷酸组成。miRNA在人体最基本的生物过程中发挥重要作用,其中包括：发育、分化、凋亡及增殖,而且作为翻译后修饰调节因子可降解目的mRNA或者抑制mRNA翻译。文献表明miRNA的异常表达与多种癌症的发生和发展相关。并且一部分miRNA被证实在乳腺癌中水平升高或者降低,如miRNA 92a、miRNA 21等。这种趋势就推动本研究去把miRNA当做一种肿瘤标记物来研究,探索在伴随乳头溢液的乳腺癌中相关miRNA所发挥的重要作用。文献中表明人类体液中miRNA可以抵抗核糖核酸酶的降解作用,并且可以作为检测相关癌症的肿瘤标记物进行临床应用。但是,目前并没有相关文献研究证实乳头溢液中是否存在miRNA,或者是伴随乳头溢液的乳腺癌与特定miRNA水平之间的关系研究。乳头溢液检查有众多优势,如取材快速、无创检查、溢液中目的成分浓度高等,方便临床应用。乳头溢液中肿瘤标记物的检测对诊断良性与恶性乳腺疾病有较好的预测能力。本论文研究的主要目的在于探讨人乳头溢液中及乳汁中糖蛋白类肿瘤标记物CEA、CA153及CA125等浓度与不同乳腺疾病的关系,并且比较肿瘤标记物及其他临床病理指标与乳腺疾病最终诊断之间的联系。本研究首次检测乳头溢液中miRNA水平,探讨miRNA作为乳头溢液中肿瘤标记物的可行性。由于miRNA在肿瘤发生和发展过程中具有重要作用,本课题拟对miRNA在乳腺癌中的表达及对乳腺癌细胞活性的作用做进一步研究。并希望能够通过肿瘤标记物水平测定,为伴随乳头溢液的乳腺癌的诊断、治疗及预防提供新的思路,对于其早期诊断、疗效监测等方面都有重要意义。材料与方法第一部分,用于糖蛋白类肿瘤标记物检测的336例乳头溢液标本取自2012年2月至2015年5月山东大学齐鲁医院乳腺外科入院患者。336例乳头溢液标本包括：96例乳腺癌(35例浸润性导管癌[IDC],29例导管内乳头状癌[IPC]和32例导管内原位癌[DCIS])以及240例良性乳腺疾病(182例导管内乳头状瘤[IDP]和58例导管扩张症[MDE])。收集56例健康产妇初乳为健康对照。所有标本使用三明治式电化学免疫发光分析法(ECLIA)进行肿瘤标记物检测,对健康对照组、良性乳腺疾病组和乳腺癌组进行数据比较。运用统计学分析可能发生乳腺癌的危险因素。第二部分,收集6例临床患者乳头溢液进行microRNA微阵列分析(miRNA microarray)筛选,选取在乳腺癌组中表达突出的miRNA,再次对21例乳头溢液标本进行实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)验证及反应产物的测序分析。选用不同亚型的乳腺癌细胞系和正常乳腺细胞系进行目的miRNA(miR-4732-5p)水平测定。并在配对临床标本(乳腺癌组织及其癌旁组织)再次进行实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)验证。并对miR-4732-5p进行一系列综合实验,包括脂质体转染、RNA过表达、MTT比色法、Annexin V-FIFC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡等。对miR-4732-5p影响不同亚型乳腺癌细胞系迁移、增殖、凋亡等细胞活性的作用进行了研究分析。根据miRNA-4732-5p下游基因预测结果,对乳腺癌细胞系和乳腺组织进行目的基因检测,确认基因表达水平。上述研究构成了一整个体系,研究乳头溢液中糖蛋白类肿瘤标记物和miRNA与乳腺癌之间的关系。本研究中所有P值均为双向,且P值小于0.05被认为是有统计学意义。结果1.乳头溢液中糖蛋白类肿瘤标记物的表达(1)CEA和CA153在区分良恶性乳头溢液上有临床意义,CA 125的测定水平在乳腺癌组和良性疾病组之间无明显统计学差异(P值为0.397)。CEA、CA 153和CA125对应的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.827、0.706、0.464。CEA作为肿瘤标记物用来区分良恶性乳腺疾病的分界值是263.3 ng/mL,相对应的特异度和灵敏度分别是88.4%和62.5%。CA153作为肿瘤标记物用来区分良恶性乳腺疾病的分界值是1235.3 U/mL,相对应的特异度和灵敏度分别是71.6%和62.4%。(2)CA199和AFP在良恶性乳腺疾病中表达无差异,虽然CA724在乳腺癌组的表达趋势高于良性乳腺疾病组,根据统计学计算乳头溢液中CA199、CA724及AFP并不能区别良恶性乳腺疾病,其P值均大于0.05。(3)乳汁与乳头溢液中的CEA、CA153和CA125表达有差异。乳腺癌患者乳头溢液中的CEA、CA153和CA125的表达水平要明显高于健康对照组和良性乳腺疾病组(P值均明显小于0.001)。将乳腺癌组患者和健康对照组进行比较,结果发现乳腺癌患者一组中乳头溢液中CEA、CA153和CA125的中位水平分别相较于对照组升高了38.7倍、3.9倍和7倍。良性疾病患者的乳头溢液中CEA和CA125的水平明显高于健康对照组,而CA153并没有表现如此趋势。2.乳头溢液中的miRNA的筛检与miR-4732-5p的功能研究(1)在微阵列分析筛选过程所包含的3100种人]miRNA中,共有10种miRNA的表达水平在两组数据比较中存在明显差异。其中miR-4732-5p、miR-4687-3p和miR-S1-5p在乳腺癌组明显低表达,具有统计学意义。除外miR-S1-5p,所有经验证的乳头溢液miRNA (miR-4732-5p和niR-4687-3p)表达水平均使用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测得。miR-4732-5p在验证实验中保持结果一致性,乳腺癌组的表达远低于良性对照组。(2)miR-4732-5p在不同亚型乳腺癌细胞系中的表达低于正常乳腺细胞系：本研究将8种不同亚型的乳腺癌细胞系(MCF-7、 MDA-MB-453、MDA-MB-157、MDA-MB-231、ZR-75-1、SK-BR-3、 BT549、T47D)和人类正常乳腺细胞系MCF-10A分别进行miR-4732-5p的实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)重复实验测定,8种乳腺癌细胞系的miR-4732-5p的表达均明显低于人类正常乳腺癌细胞系MCF-10A。(3)miR-4732-5p在配对乳腺癌组织和癌旁组织中表达有差异：所有入组成对标本中, 有78.6%的乳腺癌组织中所表达的miR-4732-5p低于对应的癌旁组织。并根据术后病理结果分析：在所有乳腺癌患者中,临床分期越晚,miR-4732-5p表达水平越高；有淋巴结转移的患者的乳腺癌组织中miR-4732-5p表达水平越高,且随着淋巴结转移数目的升高,miR-4732-5p表达水平升高。(4)miR-4732-5p影响乳腺癌细胞系的细胞活性：在不同亚型乳腺癌细胞系(MD-MB-231及T47D)中,过表达的miR-4732-5p对乳腺癌细胞的迁移和增殖有明显抑制作用,具有统计学意义,过表达miR-4732-5p对乳腺癌细胞的凋亡并不具有明显抑制作用。(5)miR-4732-5p的下游基因检测：通过对]miR-4732-5p下游基因预测,将备选目的基因ALKBH5、ANKRD 17、BCLAF1、CPSF6、 NHLH1、PPM1E、PSMA5分别在不同亚型乳腺癌细胞系中及配对临床乳腺癌和癌旁组织中进行检测,ALKBH5、NHLH1、PPM1E、PSMA5可能为miR-4732-5p下游目的基因,且miR-4732-5p与下游目的基因的表达呈负相关。结论1.乳头溢液中的CEA、CA153和CA125检测水平大大高于乳汁,支持临床上乳头溢液为病理性溢液。2.乳头溢液中CEA和CA153检测有助于临床鉴别诊断乳腺良恶性疾病,可作为乳头溢液疾病的临床检查,有推广价值。3.乳头溢液中CA125等其他糖蛋白类标志物检测对鉴别诊断乳腺良恶性疾病作用不大。4.良、恶性乳腺疾病所致乳头溢液中存在某些特异miRNA表达的差异,其中miR-4732-5p在乳腺癌组的表达远低于良性对照组。5.miR-4732-5p在乳腺癌组织中及多种乳腺癌细胞系中均为低表达；miR-4732-5p对乳腺癌细胞的迁移和增殖具有抑制作用；其有可能成为乳腺癌治疗研究的新靶点。意义1.目前临床需要一种高效的诊断方法来辅助乳腺导管造影术和乳头溢液脱落细胞学检查,对乳头溢液进行临床前期检测并筛查良恶性乳腺疾病。乳头溢液中CEA和CA153的水平测定可作为常规检验辅助诊断不同乳腺疾病,并已在临床工作中进行推广。.乳头溢液中miRNA的筛检和实验验证,miR-4732-5p在乳腺癌中的低表达可区别良恶性乳头溢液。其作为肿瘤标记物有重大临床意义,miRNA在肿瘤发生和发展过程中具有重要作用。2.乳头溢液中糖蛋白类肿瘤标记物及miRNAs在良恶性乳腺疾病之间的表达差异,CEA和CA153及其他临床病理指标与乳腺疾病最终诊断之间的联系,均有助于理解乳腺疾病的发生和发展。人乳头溢液及乳汁中肿瘤标记物CEA、CA153及CA125浓度差异,在理论上证实了生理性与病理性乳头溢液的差异。3.对miRNA在乳腺癌作用机制上有更深刻的了解,miR-4732-5p有可能作为乳腺癌诊疗研究的新靶点。通过miRNA水平测定,为伴随乳头溢液的乳腺癌的诊断、治疗及预防提供新的思路,对于其早期诊断、疗效监测等方面都有重要意义。