微孢子虫（Microsporidia）是一类专性寄生于细胞内的单细胞真核微生物,在自然界中广泛存在。微孢子虫寄主广泛,影响宿主的生长发育,严重时可导致宿主死亡。家蚕微粒子（Nosema bombycis,N.b）是最早被认识的微孢子虫,也是Nosema属的重要成员之一,它能够感染重要泌丝经济昆虫家蚕（Bombyx mori）引发家蚕微粒子病（Pébrine）,给养蚕业造成巨大的经济损失。因此,对家蚕微粒子生活史的研究以及对其侵染路径和增殖过程进行标记示踪,将为家蚕微粒子的基础研究和有效防控奠定基础。家蚕微粒子具有严格的寄生生活方式,只有在宿主细胞内才能进行增殖,完成生活周期。目前微孢子虫示踪大多采用标记成熟微孢子虫的方法,而胞内阶段的未成熟微孢子虫很难被发现,且不能对微孢子虫进行活体标记和实时观察,限制了对其生活周期和侵染增殖机制的研究。可视化的示踪技术是研究病原入侵、增殖以及和宿主互作的有效手段,通过基因操作实现外源荧光蛋白活体示踪已在其他病原中广泛应用,但由于缺乏微孢子虫遗传操作体系,现阶段尚未获得活体示踪微孢子虫。鉴于此,本文首先对家蚕微粒子侵染BmE-SWU1细胞的特征进行了分析,然后尝试不同的转基因方法,并结合家蚕微粒子生活史中不同发育阶段的结构特征,对示踪家蚕微粒子的创制进行探索。主要研究结果如下:1.家蚕微粒子侵染BmE-SWU1细胞的特征透射电子显微镜观察发现,在家蚕微粒子侵染BmE-SWU1细胞后3 h,可在细胞内观察到芽体（孢原质）时期的家蚕微粒子,并在感染后9 h发现芽体体积增大;在感染后48 h、72 h和84 h依次观察到正在分裂的裂殖体、质膜增厚的孢子母细胞以及具有完整结构的新生孢子。通过RT-PCR分析家蚕微粒子侵染后各时间点微管蛋白基因Nbβ-Tublin、孢壁蛋白基因NbSWP5、几丁质合成酶1基因NbCs-1（Chitin synthase 1）、极管蛋白基因NbPTP2和DNA复制许可因子6基因NbMCM6（DNA replication licensing factor MCM6）基因的表达情况,发现相关基因的表达水平与家蚕微粒子发育过程特点相符。利用NbPTP2抗体、DAPI和荧光增白剂28对BmE-SWU1细胞中的家蚕微粒子进行标记观察,可对胞外感染期、裂殖体时期、孢子母细胞时期和成熟孢子时期的家蚕微粒子进行区分。以上研究结果表明,家蚕微粒子感染宿主BmE-SWU1细胞后,84 h完成一个生活周期,在0³ h为感染期,3⁴8 h为裂殖增殖期,72 h后已进入孢子增殖期。2.示踪家蚕微粒子创制构建含有不同启动子的pIZ-OpIE2-DsRed、pig-A3-EGFP、pSL1180-NbCDCP23-DsRed和pSL1180-NbPTP2-DsRed四个荧光蛋白表达载体,通过多次脂质体转染的方式,将质粒导入感染家蚕微粒子后的细胞,仅在转染了pIZ-OpIE2-DsRed和pig-A3-EGFP的实验组中观察到呈现荧光的示踪家蚕微粒子。采用电转化成熟家蚕微粒子的导入方法,未能获得示踪家蚕微粒子。采用电转化感染家蚕微粒子后的细胞的方法,在感染后9 h和48 h进行电转化,均发现呈现荧光的示踪家蚕微粒子,而在感染后60 h的电转化实验组中则没有观察到。体腔注射转染已感染家蚕微粒子的蚕体,导入pig-A3-EGFP表达载体,结果在蚕体组织中观察到部分家蚕微粒子呈现绿色荧光。以上研究结果表明,OpIE2^prm和A3^prm启动子在家蚕微粒子中能够启动荧光蛋白表达;家蚕微粒子的裂殖增殖期有利于荧光蛋白基因的转化;通过转染感染家蚕微粒子后的细胞和蚕体以及电转化感染家蚕微粒子后的细胞的方法导入荧光蛋白基因是可行的。3.示踪家蚕微粒子的收集和鉴定收集蚕体转染实验获得的示踪家蚕微粒子,提取基因组,进行PCR检测,结果扩增出EGFP的特异条带。进一步将收集的示踪家蚕微粒子再接种于细胞,发现示踪家蚕微粒子能够正常侵染宿主细胞,并在宿主细胞内进行增殖,产生新生的孢子,在感染后8 d内均可观察到呈现荧光的示踪家蚕微粒子。以上研究结果表明,A3^prm-EGFP表达元件能进入家蚕微粒子的基因组,并能启动荧光蛋白的表达,但荧光信号强度较弱,可能与导入效率较低或者启动子启动活性较低等原因相关。综上所述,本研究明确了家蚕微粒子侵染家蚕胚胎细胞系BmE-SWU1后的生活史特征,探索了多种创制示踪家蚕微粒子的方法,获得了呈现荧光信号的示踪家蚕微粒子,同时筛选到可用的荧光蛋白表达载体,并确定了载体导入和结果检测的最佳时间,初步建立了一种创制示踪家蚕微粒子的方法。