本实验室最近两年对松花粉多糖的研究主要集中在脂肪细胞、癌细胞和免疫细胞等方面。其中针对免疫细胞的研究又包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞的增殖及钙离子相关的信号通路之间的研究。虽然本实验室已完成了较多的工作,但是在马尾松花粉多糖与细胞的具体的作用是在细胞内还是细胞外仍然不是十分明确。另外,由于松花粉多糖分子无发光的基团、在细胞内作用复杂等原因,上述问题的研究比较困难。鉴于这些原因,本次实验确定将马尾松花粉多糖进行荧光标记后再探讨其与细胞的作用。本文主要包括以下内容:一、对马尾松花粉粗多糖进行提取,本次实验采用本实验室比较成熟且一直使用的热水浸提法。然后将去除蛋白的粗多糖用20%、40%、60%、80%浓度的乙醇分级沉淀。其中,活性较好的60%乙醇沉淀的粗多糖是本此实验所需多糖,命名为PPM60。二、对PPM60进行荧光标记。第一步,PPM60与酪胺反应生成的PPM60-Tyr用凝胶柱Sephacryl S-400HR进行层析,用紫外分光光度计能够280nm下测得较强的吸收峰。第二步,PPM60-Tyr与FITC的反应,生成物命名PPM60-Tyr-FITC,生成的PPM60-Tyr-FITC再用Sephacryl S-400HR层析,层析的结果用紫外分光光度计、荧光分光光度计测FITC的吸收峰,用苯酚-硫酸法测多糖的吸收峰,最后对比,在前30管内有两个峰符合要求命名为峰1和峰4。之后再用Sephacryl S-400HR层析柱分别对这两个峰纯化2-3次。纯化后的峰1和峰4分别计算取代度为4.32%和0.66%,都达到了后期使用流式细胞仪等机器检测时对灵敏度的要求。经过检测的结果的分析表明本次荧光标记实验是成功的。三、研究PPM60-Tyr-FITC对细胞增殖作用的影响。鉴于上述试验中所得的峰1的荧光强度高于峰4,所以选取峰1开展研究。结果表明PPM60-Tyr-FITC对细胞的活性影响不大,满足作用于细胞的实验要求,其中400μg/mL的PPM60-Tyr-FITC为最适浓度。四、研究PPM60-Tyr-FITC与巨噬细胞RAW264.7的受体TLR4的作用。使用流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜等设备,检测标准品FITC-dextran和PPM60-Tyr-FITC与细胞作用的情况。结果表明FITC-dextran和PPM60-Tyr-FITC都能随着时间的增加由外而内的进入细胞。用抑制剂抑制关键内吞相关蛋白及受体的作用的实验结果表明,网格蛋白及TLR4在FITC-dextran和PPM60-Tyr-FITC进入细胞的过程中起了关键作用。五、研究PPM60-Tyr-FITC与大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6的受体TLR4的作用。实验结果也表明网格蛋白及TLR4在FITC-dextran和PPM60-Tyr-FITC进入细胞的过程中起了关键作用。