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漆酶（EC1.10.3.2）是一种多酚氧化酶,其T1 Cu位点获得底物电子被还原,通过漆酶内部电子传递链,电子最终被传递到TNC区域将O2还原为水。漆酶具有底物特异性低、产物环保等特点,使其在食品工业、环境保护和制浆造纸等多个领域得到应用,是一种具有优良特性的绿色催化剂。Thermus thermophiles SG0.5JP17-16所产漆酶lac TT,是一种细菌漆酶,有很好的耐p H、耐高温和耐高浓度盐离子等特性。根据序列对比和结构分析,预测了底物结合loop上可能对催化有影响的5个位点:E199、D289、R290、D394和D396,将这些位点突变为Met,根据催化效率的变化筛选出Asp394和Asp396两个重要位点,研究这两个位点在催化过程中的作用:（1）Asp394位点的功能研究。酶学性质研究显示:突变体最适p H均酸移,热稳定性下降明显。动力学数据揭示:与野生型相比,D394E、D394M和D394R突变体催化效率降低,而D394N突变体的催化效率与野生型相似。紫外可见吸收光谱数据表明,D394E、D394M和D394R突变体在608 nm附近吸收强度低于野生型,T1 Cu结构可能受到了扰动,可能进一步影响了突变体的催化效率。前人研究揭示了T1 Cu配体H397在电子传递过程中具有重要作用,我们的结构分析阐明,野生型和D394N突变体中的氢键网络包含T1 Cu配体残基H397,而D394E、D394M、D394R突变体中H397不在氢键网络中。氢键网络的改变可能导致D394E、D394M、D394R突变体催化效率降低。野生型和D394R突变体的CD光谱显示,D394突变体的二级结构发生了变化,结合结构数据,D394到E394、M394及R394的变异可能引起了D394所在loop的构型发生了变化。氧化还原电位结果表明,D394E、D394M、D394R突变体的氧化还原电位低于野生型,电位的降低也可能导致突变体催化效率降低。综上,D394到E394、M394及R394的突变可能影响其所在loop的构型而改变氢键网络、T1 Cu位点的结构和电势,进一步影响漆酶催化效率。D394R突变体与野生型的脱色实验阐明,D394R突变体与野生型相比对3种偶氮染料RBB、RBWNN和CR的脱色率相似,对蒽醌类染料RBBR的脱色率下降明显。（2）Asp396位点的功能研究。酶学性质研究显示:突变体最适p H均酸移至5.0,最适温度和热稳定性与野生型相似。动力学数据揭示:与野生型相比,D396A、D396E、D396M突变体的催化效率升高,而D396N突变体催化效率与野生型相似。紫外可见光谱数据表明,D396A、D396E和D396M突变体在608 nm吸收峰强度变化,说明T1 Cu结构可能受到扰动。野生型与D396M突变体的CD谱显示,T1 Cu附近二级结构发生了变化。结构分析表明,野生型与D396N突变体在底物入口形成D396-Y288和N396-Y288氢键,而在D396A、D396E、D396M突变体中这个氢键消失,新形成L427-H397氢键,且D396A突变体的空间位阻小于野生型,这些改变可能导致D396A、D396E、D396M突变体催化效率升高。综上,D396到A396、E396和M396的突变改变了周围残基间氢键网络、空间位阻和T1 Cu位点的结构,进而影响漆酶的催化。脱色实验显示,D396M突变体对RBB、RBWNN、CR的脱色率和野生型相似,对RBBR的脱色率比野生型高7%。