由水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)引起的水稻瘤矮病在我国南方稻区一直处于持续流行态势,是重要的水稻病害之一。RGDV由介体电光叶蝉以持久增殖型的方式进行传播,并且可以垂直传播。病害的流行与介体昆虫的传播有着直接的关系,因此本论文对RGDV突破介体昆虫唾液腺屏障水平传播至植物以及经介体昆虫生殖系统垂直传播至子代的机制进行了研究,探讨了不同传播方式对田间病害流行的影响。持久性病毒在介体昆虫内侵染循环,最后到达唾液腺,跨过唾液腺细胞中的内腔质膜释放到唾液中。围成内腔的质膜作为病毒在虫体内的最后一道膜屏障,对于病毒的传播起着决定作用。本研究首先利用电镜技术和免疫荧光标记技术,观察了 RGDV突破唾液腺释放屏障的过程,发现RGDV侵入电光叶蝉唾液腺后,自身编码的非结构蛋白Pns11可以形成纤维状结构,这一结构通过与质膜的主要组分肌动蛋白(actin)互作,一侧结合在质膜上,另一侧附着了病毒粒体,凹陷并形成小泡,以类似"胞吐"的方式介导病毒跨过质膜释放到唾液中。我们利用RNA干扰技术进一步验证Pns11纤维结构在病毒突破唾液腺释放屏障中的作用。通过微针注射针对Pns11基因的dsRNA抑制Pns11纤维结构在唾液腺中的形成,有效地减少了病毒向唾液腺内腔中的释放,并且降低了介体昆虫的传毒率。因此,病毒非结构蛋白Pns11可以在唾液腺细胞中形成纤维结构,是介导病毒跨过内腔质膜释放屏障的"交通工具"。这种病毒利用自身形成的内含体结构跨过内腔质膜的方式是虫传病毒突破唾液腺屏障的新模型。病毒随着唾液一起传播到植物,唾液作为病毒从昆虫进入植物的载体,对于病毒-介体昆虫-植物三者之间的互作起着"桥梁"的作用。本研究分别收集了带毒和无毒电光叶蝉的水状唾液,利用蛋白质非标记定量技术(Label-free technology)进行了测定,通过与电光叶蝉唾液腺转录组数据比对,共鉴定获得了 955个蛋白。通过定量分析发现,获得的蛋白中有209个为带毒昆虫的唾液所特有,有237个是无毒昆虫的唾液特有,其分子功能的类别主要富集在氧化还原酶相关的条目中,这类酶可以帮助昆虫对抗植物因被取食而产生的具有毒害作用的酚类物质,具有一定的"解毒"作用,影响着昆虫的取食。因此RGDV的侵染使介体电光叶蝉的唾液组分发生了变化,并且可能影响昆虫取食的效率。病毒从亲代传递给子代,叫做垂直传播。病毒经介体昆虫的垂直传播对毒源的维持和病害的发生具有重要意义。前期研究发现,RGDV从亲代到子代昆虫的垂直传播效率高达80%以上,但是带毒雌虫卵巢的侵染率仅有25%左右。本研究首先通过带毒和无毒昆虫的交配实验,发现带毒雌虫与带毒雄虫(V♀×V♂)交配后的子代昆虫带毒率约为81%,无毒雌虫与带毒雄虫(N♀×V♂)交配后的子代昆虫带毒率约为73%,而带毒雌虫与无毒雄虫(V♀×N♂)交配的子代昆虫带毒率仅为22%,因此RGDV可以经父本进行垂直传播,并且这种垂直传播方式非常高效且处于主导地位。利用电镜和免疫荧光标记技术进一步研究了 RGDV经父本进行垂直传播的路径。我们发现,RGDV附着在电光叶蝉精子的头部,被精子携带通过交配进入雌虫,在产卵时随精子通过授精作用进入卵中传递至子代。体外孵育实验发现,RGDV的主要外壳蛋白P8可以特异结合在精子头部。通过GST pull-down钓取与P8互作的精子蛋白,获得了硫酸乙酰肝素糖蛋白(heparan sulfate proteoglycans,HSPG)候选受体。进一步通过酵母双杂交实验和pull-down实验,明确了 P8与HSPG的结构功能域III存在互作。免疫荧光标记结果显示,HSPG分布在精子头部的质膜上,病毒粒体结合在HSPG上。利用HSPG抗体孵育精子后可以体外阻断病毒与精子的结合。因此,RGDV通过外壳蛋白P8与电光叶蝉精子头部质膜的HSPG蛋白互作,介导精子携带病毒通过交配传至子代。生物学实验发现,RGDV的侵染会显著缩短电光叶蝉雌性成虫的寿命,但对雄性成虫的寿命和交配能力不造成显著影响。无毒雌虫与带毒雄虫交配(N♀×V♂)产下的卵,其孵化率和形态与无毒虫间交配(N♀×N♂)产下的卵接近,明显优于带毒雌虫与无毒雄虫交配所产的卵。因此推测RGDV更适合于在雄虫中存在,RGDV经雄虫垂直传播对种群的不利影响较小。田间调查结果显示,电光叶蝉是田间的主要介体昆虫,其带毒率与田间发病程度有一定相关性,且雄虫的带毒率显著高于雌虫。越冬期田间缺少寄主植物,越冬代昆虫的带毒率直接影响着次年水稻种植期的叶蝉带毒率和田间发病程度,因此病毒在电光叶蝉中的垂直传播对毒源维持和病害发生具有重要意义。综上所述,本论文明确了 RGDV在电光叶蝉中突破唾液腺释放屏障进行水平传播的机制,分析了 RGDV侵染对介体昆虫唾液蛋白造成的变化,发现了 RGDV在电光叶蝉中以雄虫交配为主雌虫经卵为辅的一种奇特的垂直传播方式,并揭示了病毒主要外壳蛋白P8与精子质膜受体HSPG互作介导精子携带病毒传递至子代的机制,初步探讨了这一垂直传播方式对电光叶蝉种群和病害流行的影响,为探索水稻病害的流行规律和进行有效防控提供了理论依据。