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目的:明确YAP的表达水平是否会影响乳腺癌患者的预后以及影响免疫细胞的功能,诱导免疫耐受形成。方法:1.通过临床数据库分析（http://hgserver1.amc.nl/cgi-bin/r2/main.cgi）乳腺癌肿瘤组织中YAP表达水平与乳腺癌患者预后的关系。2.通过对临床乳腺癌患者标本进行免疫组化实验及HE染色,评估乳腺癌组织中YAP表达水平与肿瘤浸润淋巴细胞的相关性。3.在乳腺癌细胞系HCC-1937和MDA-MB-231中分别转染YAP的质粒及si RNAs,通过western blot验证。4.通过淋巴细胞杀伤实验,将活化的PBMC与乳腺癌细胞共培养一段时间后,利用流式细胞术（Flow cytometry）检测淋巴细胞对YAP表达水平差异的乳腺癌细胞的免疫杀伤作用变化。5.通过淋巴细胞活化实验,将PBMC与乳腺癌细胞共培养,利用流式细胞术检测YAP表达水平差异的乳腺癌细胞对淋巴细胞的活化的影响。6.通过利用CRISPR/Cas9技术,获得小鼠乳腺癌细胞系4T1 YAPKO稳定细胞株,并通过western blot验证。7.通过小鼠皮下移植瘤实验,将鼠源性乳腺癌细胞系4T1 YAP KO稳定细胞株及对照细胞株皮下注射入BALB/c小鼠皮下,通过流式细胞术检测小鼠乳腺癌肿瘤组织浸润淋巴细胞功能以及通过比较肿瘤大小,检测YAP对肿瘤生长的影响。结果:1.通过临床数据库分析,我们发现在乳腺癌中,YAP高表达患者预后明显较差。2.我们通过免疫组化和HE染色,发现临床乳腺癌患者标本中YAP在肿瘤组织中的表达水平与肿瘤局部的淋巴细胞浸润呈正相关关系。3.通过western blot证明,在HCC-1937中YAP质粒转染可以成功提高YAP的蛋白表达水平,在MDA-MB-231中转染YAP的si RNA能够显著敲低其内源性的YAP蛋白水平,其中我们筛选了敲低水平较高的2#和3#si RNA序列用于后续的实验。4.将PBMC与CFSE标记的HCC-1937或MDA-MB-231乳腺癌细胞系共培养后,PBMC对YAP高表达的HCC-1937杀伤作用减弱,而对敲低YAP的MDA-MB-231的杀伤作用更强。5.PBMC与HCC-1937或MDA-MB-231乳腺癌细胞系共培养后,与YAP敲低的MDA-MB-231共培养的PBMC中CD8+细胞中的Granzyme B表达增加,淋巴细胞活化增加;而与YAP高表达的HCC-1937共培养的PBMC中CD8+细胞中的Granzyme B表达减少,淋巴细胞活化下。6.通过western blot检测,获得小鼠乳腺癌4T1 YAPKO稳定细胞株。7.通过收获小鼠皮下移植瘤,我们发现4T1 YAPKO的肿瘤大小平均小于对照组,证实YAP影响肿瘤的生长,进一步通过提取肿瘤组织中的细胞,通过流式细胞术,我们发现4T1 YAPKO组的CD8+细胞的IFN-γ、Granzyme B等淋巴细胞效应分子增加,提示4T1 YAPKO组肿瘤浸润淋巴细胞中CD8+T细胞活化水平下降。结论:YAP的高表达可以作为乳腺癌患者预后不良的重要指标,而YAP高表达的肿瘤组织中浸润的淋巴细胞反而增多,提示YAP高表达的肿瘤浸润淋巴细胞失去功能;通过体内体外实验,YAP抑制淋巴细胞的活化以及杀伤作用。目的:明确YAP诱导肿瘤免疫耐受的具体机制。方法:1.购买美国R＆D Systems公司的Human Cytokine Array芯片,该芯片被用于检测样本中36种细胞因子、趋化因子和急性期蛋白,并进行高通量多分析,检测肿瘤细胞YAP表达水平变化导致的免疫相关细胞因子的变化,并统计分析,筛选相关细胞因子。2.通过GEO数据库,获得乳腺癌细胞系MDA-MB-231的基因表达谱芯片,分析YAP敲低后免疫相关细胞因子表达的关系。3.利用YAP高表达质粒及si RNAs,在乳腺癌细胞系HCC-1937和MDA-MB-231中过表达或敲低YAP,利用western blot验证YAP与ICAM1的关系。4.在乳腺癌细胞系HCC-1937和MDA-MB-231中过表达或敲低YAP,并通过RT-q PCR法检测YAP与ICAM1表达的关系。5.通过sh RNA获得YAP KD的MDA-MB-231稳定细胞株,并通过western blot验证。6.通过细胞粘附实验,将Jurkat细胞或CFSE标记后的人外周血淋巴细胞（PBMC）与乳腺癌细胞系MDA-MB-231共培养,通过电镜观察或者荧光显微镜计数,验证YAP对淋巴细胞粘附功能的影响。7.利用si RNAs和抗ICAM1抗体,通过细胞粘附实验,验证淋巴细胞粘附与ICAM1的关系。8.通过淋巴细胞杀伤实验,验证YAP通过ICAM1影响淋巴细胞杀伤功能。结果:1.通过对细胞因子芯片的实验结果进行统计分析,我们发现MDA-MB-231中YAP敲低后,CCL2、G-CSF、ICAM1等8种细胞因子表达水平发现变化。2.GEO数据库中的基因表达谱芯片的结果分析提示,MDA-MB-231中YAP敲低后,上述细胞因子中ICAM1的m RNA水平变化差异最明显。3.通过western blot以及RT-q PCR,在蛋白质水平以及m RNA水平,验证了YAP与ICAM1呈负相关关系。4.通过western blot验证YAP KD效率以及再次验证YAP与ICAM1成负相关关系。5.通过细胞粘附实验,我们发现淋巴细胞或永生化人T淋巴细胞系对YAP KD的MDA-MB-231的粘附能力更显著,提示乳腺癌细胞系YAP表达可以抑制淋巴细胞或永生化人T淋巴细胞系对乳腺癌的粘附能力。6.通过si RNAs敲低ICAM1或通过抗ICAM1单抗封闭肿瘤细胞表面ICAM1,我们发现PBMC对乳腺癌细胞系的粘附能力减弱,提示YAP通过ICAM1抑制淋巴细胞粘附功能。7.通过淋巴细胞杀伤实验,YAP KD组细胞株使用抗ICAM1单抗处理后,PBMC对其杀伤能力减弱,提示YAP通过ICAM1抑制淋巴细胞杀伤功能。结论:YAP与ICAM1在蛋白质水平与m RNA水平负相关关系;YAP可以通过ICAM1影响淋巴细胞的粘附功能和杀伤功能;