论文部分内容阅读
氧气在需氧生物中具有极其重要的作用。机体持续处于缺氧状态,将会引起机体损伤甚至相关疾病的发生。生物体为了适应低氧环境,需要调控与缺氧相关基因的转录表达,以此来适应低氧应激。可变剪接是真核生物调控基因表达的一种重要方式,是构成复杂蛋白质组和基因表达模式复杂程度的主要原因。大量研究报道,很多缺氧相关基因通过可变剪接以不同的剪接变体参与缺氧应答并发挥重要的调控作用,并且可变剪接与很多缺氧相关疾病的发病机制有密切联系,但是目前对可变剪接在缺氧应答中的具体调控机制却知之甚少。为了探讨可变剪接在低氧应答中的调控作用,本课题以模式生物秀丽线虫为研究材料,采用feeding RNAi筛选技术,以线虫体内351个RNA结合蛋白(RNA-binding protein, RBP)编码基因及与缺氧相关且有实验证据支持的具有可变剪接形式的基因即候选靶基因为筛选对象,寻找影响秀丽线虫缺氧损伤表型的剪接调控因子及靶标。结果显示,有10个基因被RNAi后的缺氧表型与N2相比具有显著性差异,其中包括6个RBP编码基因(F46A9.6,T26G10.1,M03D4.6,R09A1.1,T07D1.4,F18H3.3)和4个候选靶基因(W01C9.5,H21P03.2,F22E12.4,K09G1.4)。由于RNAi存在一定的不确定性,因此需要利用阳性基因的功能丧失型突变株系对RNAi筛选的结果做进一步的验证。结果显示,突变株系mec-8(ok2043),mec-8(u314)和egl-9(sa307)的物理缺氧表型与RNAi的物理缺氧表型一致,其中mec-8(ok2043)物理缺氧表型为缺氧敏感,而mec-8(u314)和egl-9(sa307)物理缺氧表型为缺氧耐受。结果说明基因mec-8和egl-9在缺氧应答中可能发挥重要的作用。为了进一步在分子水平上证明egl-9是否参与低氧应答及其何种变体参与缺氧应答,进而通过RT-PCR的方法检测了elg-9部分剪接变体缺氧前后mRNA表达水平的变化。结果显示elg-9部分剪接变体缺氧后mRNA表达水平下调。此外拟通过功能恢复性实验进一步证明egl-9剪接变体在低氧应答中的调控作用,通过构建egl-9变体的表达载体并通过显微注射制备转基因线虫。目前已经成功构建剪接变体的表达载体,并且获得了各变体的转基因线虫,为下一步的实验奠定了基础。综上所述,本研究揭示了可变剪接在低氧应答中具有重要的调控作用,为进一步研究调控机制奠定了重要基础,并为缺氧相关疾病发病机制的研究提供了重要线索。