研究背景及意义结肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。在欧美发达国家,结肠癌是发病率排名前三的恶性肿瘤,更是美国男性、女性癌症死亡的第三大原因。近年来,在我国,随着经济水平的提高,东西方文化交流的增加,人们的生活方式、生活习惯都发生了很大的变化,导致我国结肠癌的发病率显著上升。结肠癌是一种多因素多机制作用导致的恶性疾病,它的影响因素遍布我们生活的各个方面,故在防治方面增加了难度。但是结肠癌发展缓慢,早期治愈率高,5年生存率达到90%以上。所以加强对结肠癌的研究,不断探索出更多更好的早期筛查和诊断的方法,对于结肠癌的早期诊断、及时治疗以及预后改善都具有很大的意义。Wnt/β-catenin信号通路的高度激活可以促进细胞的增殖和生长,是很多肿瘤细胞(尤其是结肠癌细胞)发生发展的重要的调节途径。90%以上的结肠癌患者都有Wnt／β-catenin信号通路中关键调节因子的变性。这些或正或负调节因子的变性最终都会引起β-catenin的入核增加,进入核内的β-catenin可以与核内的TCF/LEF转录因子形成复合体,促进下游靶基因c-myc、cyclinDl等表达的增加,进而促进细胞的增殖和细胞形态的改变,导致肿瘤的发生。Sohlh2 (Spermatogenesis and oogenesis basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factor 2)作为一种bHLH转录因子主要调节小鼠生殖细胞的分化。然而Sohlh2在正常的人体组织中呈现较高水平的表达,而在很多的肿瘤细胞中表达较低。其中,在卵巢癌细胞中,它可以下调cyclinD1、mmp9等对肿瘤细胞有促进作用的分子的表达,抑制卵巢癌细胞的增殖和转移。Sohlh2在结直肠癌中的表达也是明显降低的,但是Sohlh2对结肠癌细胞的作用及其机制尚未有人研究。我们的研究就是通过检测Sohlh2在结肠癌细胞中的表达情况,发现Sohlh2与结肠癌细胞发生发展的关系。利用MTT、BrdU、克隆形成、FACS、 Transwell、 Matrigel、划痕实验、裸鼠皮下成瘤及远处转移、实时定量PCR、Western Blot、免疫组织化学染色、免疫荧光染色、细胞转染等实验技术,检测Sohlh2对结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和转移的影响,并进一步探索Sohlh2发挥作用的机制。Sohlh2可能成为结肠癌诊断和治疗的新的靶点。研究方法1.检测结肠癌组织中Sohlh2的表达取不同分级的临床结肠癌患者标本,制备组织芯片并进行免疫组织化学染色,观察分析正常结肠组织、结肠癌Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级组织中Sohlh2的表达。2.检测Sohlh2对结肠癌细胞增殖的影响培养结肠癌细胞系LoVo,采用细胞转染技术,分别将Sohlh2质粒、空质粒、Sohlh2 RNAi、非特异性RNAi转染进LoVo细胞,将细胞分为①空质粒+Control组(Con组)：②Sohlh2质粒+Control组(P-Sohlh2组)；③非特异性RNAi+Control组(si-Con组)；④Sohlh2 RNAi+Control组(si-Sohlh2组)四个组,前两组用800μg/mlG418,后两组用3μg/ml pd,筛选两周,建立稳转的细胞系。分别通过MTT、克隆形成、BrdU、 FACS等几种实验方法检测四组细胞增殖能力的强弱。3.检测Sohlh2对结肠癌细胞迁移、侵袭的影响用第2步所建立的四组细胞系,分别进行细胞划痕实验、Transwell及Matrigel基质胶侵袭实验,通过这几种实验方法,分别检测四组细胞的迁移和侵袭能力的不同。4.检测Sohlh2对结肠癌细胞皮下成瘤及远处转移的影响收集四组细胞,每组细胞对应5只裸鼠,进行裸鼠皮下注射,定期观察肿瘤的长出情况,待四组细胞肿瘤都有长出时,间隔测量肿瘤大小,最后取出肿瘤,称取瘤重,固定,石蜡包埋,以备后续免疫组织化学染色实验使用。准备细胞和裸鼠同前,对裸鼠进行尾静脉注射,2个月后,脱颈处死小鼠,取出肝、肺组织固定,石蜡包埋,5μm厚度切片,然后通过H&E染色,检测肿瘤肝、肺转移情况。5.探讨Sohlh2对Wnt/β-catenin信号通路的调控(1)用实时荧光定量PCR法检测四组细胞中c-myc、cyclinD1、mmp9,lgr5基因在mRNA水平的表达,通过免疫荧光、Western Blot实验方法进一步检测四组细胞中上cyclinD1、c-myc基因在蛋白水平的表达。(2)对临床结肠组织进行β-catenin的免疫组织化学染色,观察β-catenin在正常结肠组织和结肠癌组织细胞中的表达情况,以及与Sohlh2表达的关系。收集①②组细胞,提取核蛋白,通过Western Blot的实验方法检测核内β-catenin蛋白表达的差异。通过对细胞爬片的免疫荧光染色,观察β-catenin在四组细胞中的表达位点及表达量的不同。对第4步中的由Con组细胞和P-Sohlh2组细胞形成的肿瘤组织切片进行免疫组织化学染色,检测两组细胞形成的肿瘤组织中β-catenin和Sohlh2的表达情况。(3)将细胞重新分成以下四组：空质粒+Control组(Con组)；Sohlh2质粒+Control组(P-Sohlh2组)；空质粒+Control+Licl组(Con+Licl组)；Sohlh2质粒+Control+Licl组(Sohlh2+Licl组),Licl使用浓度是10mmol/L,作用24小时后,采用实时荧光定量PCR检测四组细胞中c-myc、 cyclinD1、 mmp、 lgr5基因在mRNA水平的表达,通过BrdU实验方法检测细胞的增殖能力的变化,再通过免疫荧光染色、Western Blot的实验方法检测四组细胞中Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因c-myc、cyclinDl在蛋白水平表达的不同。研究结果1、临床标本的免疫组织化学染色结果显示,Sohlh2在细胞核和细胞质中都有表达。Sohlh2在正常结肠组织中呈现较高的表达,在结肠癌中表达明显减少,差异有统计学意义(P(0.05)。而且随着结肠癌分级的增加,肿瘤分化程度的减弱,Sohlh2的表达呈现递减的趋势。2、与Con组相比,P-Sohlh2组在24h,48h,72h时的0D(490)明显减少(尺O.01),相反si-Sohlh2组比si-Con组的0D(490)明显增加,说明Sohlh2抑制结肠癌细胞的增殖。BrdU实验结果也显示,Sohlh2过表达明显抑制结肠癌细胞阳性细胞数(P＜0.01),而Sohlh2 RNAi干扰了Sohlh2的作用使阳性细胞数明显增加(P＜0.01)。克隆形成实验中P-Sohlh2组细胞克隆的数目明显少于Con组(P(0.01)的实验结果进一步揭不Sohlh2对结肠癌细胞克隆形成的抑制作用。流式细胞周期检测实验非常直观的显示P-Sohlh2组细胞被阻滞在G0/G1期,而si-Sohlh2组细胞G2/S期细胞明显增加。3、细胞划痕实验结果显示,Sohlh2过表达以后细胞的迁移率与Con组相比明显降低(P<0.05), si-Sohlh2组细胞的迁移率与si-Con组相比则明显上升(P＜0.05)。Transwell实验中P-Sohlh2组穿过小室的细胞数目明显减少(P<0.01),而si-Sohlh2组穿过的细胞显著增多(P<0.01)。Matrigel基质胶实验结果进一步说明Sohlh2不仅抑制结肠癌的迁移,还抑制结肠癌细胞的侵袭：Sohlh2过表达以后穿过基质胶进入小室膜底部的细胞明显减少(P＜0.05),小RNA干扰Sohlh2的表达以后,穿过的细胞明显增多(P＜0.01)。4、裸鼠皮下成瘤实验通过在体实验进一步证实了Sohlh2抑制结肠癌细胞的增殖,从而抑制了皮下肿瘤的生长速度。由肿瘤生长曲线和瘤重柱状图结果可以看出,Sohlh2的表达增加,肿瘤生长速度减慢,取得的肿瘤重量较轻,相反,Sohlh2的表达降低,肿瘤生长速度加快,最终的瘤重偏重。裸鼠尾静脉注射远处转移实验结果发现,Sohlh2可以明显抑制结肠癌细胞的肺组织转移(P＜0.01)；相反,抑制Sohlh2可以明显促进结肠癌细胞的肺转移(P＜0.01)。未见明显肝转移灶。5、Sohlh2过表达以后,Wnt/β-catenin信号通路的靶基因c-myc、cyclinDl、mmp9的表达无论在mRNA水平还是在蛋白水平都明显受到抑制,lgr5的mRNA的表达也减少。免疫组化和Western Blot结果显示Sohlh2与β-catenin的核内表达成负相关。加入Licl可以激活Wnt/β-catenin信号通路,使c-myc、cyclinD1、mmp9、lgr5的mRNA的表达及c-myc、cyclinDl蛋白表达增加,细胞增殖能力增强,而Sohlh2可以抑制Licl的激活作用。结论1、Sohlh2抑制结肠癌的增殖、迁移、侵袭和转移。2、Sohlh2可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活发挥作用。