背景与目的肺腺癌是一种高度异质性肿瘤,2011年IASLC/ATS/ERS国际肺腺癌新分类将肺实体为主型腺癌伴黏液产生(SPAC)归为浸润性肺腺癌的一种独立病理类型,该分类系统中SPAC包括肺实体为主型腺癌伴粘液产生及伴有粘液的完全性实体型腺癌两种类型。关于这两种类型实体型腺癌的共性和差异性目前尚无定论。最近,病理学家们发现部分肺大细胞癌(LCC)的临床病理特征及免疫表型与伴有粘液的完全性实体型腺癌难以区分,提出应将这类LCC重新分类为寡黏液的完全性实体型腺癌。因此,肺实体型腺癌可能包括实体为主型腺癌伴粘液产生、伴有黏液的完全性实体型腺癌和寡黏液的完全性实体型腺癌等一系列形态学谱系。目前对肺实体型腺癌的临床病理特征、分子学改变、预后及发病机制缺乏深入研究。我们前期应用高通量全基因组表达谱芯片分析技术对比了肺实体型腺癌、经典型肺腺癌以及相应正常肺组织中的基因表达谱,发现肺实体型腺癌中差异性表达最明显的下调靶基因—LKB1和BRGl。LKB1是一种编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的肿瘤抑制基因,在抑制细胞增殖、诱导细胞极性、调控细胞能量代谢及肿瘤转移等方面有重要作用。BRG1是依赖ATP酶的SWI/SNF染色质重塑复合物的核心亚基,参与胚胎发育、组织再生、细胞周期调控和肿瘤的分化与增殖,与肿瘤的发生发展密切相关。目前LKB1和BRG1在肺实体型腺癌的表达研究未见有文献报道。本课题将首次全面系统地对肺实体型腺癌进行系统性研究,旨在(1)进一步明确肺实体型腺癌,特别是寡粘液的完全性实体型腺癌的病理诊断标准；(2)明确肺实体型腺癌的临床病理特征、免疫表型和分子学改变,并确证肺实体型腺癌的独立预后因素；(3)明确LKB1和BRG1在肺实体型腺癌中的表达情况；(4)明确LKB1和BRG1在肺实体型腺癌中表达缺失的分子机制。材料与方法收集2003年1月～2013年12月期间病理诊断为肺实体型腺癌、低分化腺癌以及大细胞癌的肺癌手术切除标本共248例,应用光镜观察、AB/PAS组织化学染色、免疫组化等方法筛选肺实体型腺癌病例并对其进行组织学亚型分型。进一步收集所有肺实体型腺癌患者的完整临床资料并随访。应用DNA直接测序、免疫组化、FISH等方法评估EGFR、KRAS及ALK基因状态。收集7例肺腺癌及相应正常肺组织的新鲜标本,其中4例为肺实体型腺癌,3例为经典型肺腺癌,分别提取总RNA,应用NimbleGen基因芯片对各例肺腺癌组织及正常肺组织进行基因表达谱分析,筛选出肺实体型腺癌中差异性表达最明显的下调靶基因—LKB1和BRG1,并采用免疫组化方法检测肺实体型腺癌、经典型肺腺癌及正常肺组织中LKB1和BRG1蛋白表达情况,分析其表达与肺实体型腺癌患者各项临床病理学参数、EGFR、KRAS和ALK基因状态及其预后的关系。选取LKB1和BRG1蛋白表达缺失的肺实体型腺癌病例,应用DNA直接测序、FISH和甲基化特异性PCR等方法,进一步研究LKB1和BRG1在肺实体型腺癌中的缺失机制。结果1.肺实体型腺癌的临床病理特征106例肺实体型腺癌患者中男女比为4.9：1,年龄32-84岁(平均58.6岁),69例(65.1%)患者有吸烟史。按照第7版TNM分期标准,Ⅰ期27例(25.5%),Ⅱ期33例(31.1%),Ⅲ期43例(40.6%),Ⅳ期3例(2.8%)。44例(41.5%)有肿瘤内脉管侵犯、40例(37.7%)有脏层胸膜侵犯、61例(57.5%)有淋巴结转移。26例(24.5%)有远处转移,31例(29.2%)术后复发。肺实体型腺癌与经典型肺腺癌在性别、吸烟史、肿瘤最大径、脉管侵犯、胸膜侵犯、淋巴结转移、远处转移、复发及临床分期之间的差异有统计学意义(P<0.05)。与经典型肺腺癌相比,肺实体型腺癌更多见于男性吸烟、肿瘤最大径>4.5cm、伴有脉管侵犯/胸膜侵犯／淋巴结转移／远处转移及高临床分期的患者。肺实体型腺癌的三种不同组织学亚型在性别、年龄、吸烟史、肿瘤部位、肿瘤最大径、脉管侵犯、胸膜侵犯、淋巴结转移、远处转移、复发及临床分期之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。2.肺实体型腺癌的组织学特征按照肺实体型腺癌的主要病理学特征,106例肺实体型腺癌进一步分为实体为主型腺癌伴黏液产生41例、伴有黏液的完全性实体型腺癌23例、寡黏液的完全性实体型腺癌42例。(1)实体为主型腺癌伴黏液产生(SPAC)肿瘤以实性片状生长为主,实性区域缺乏贴壁、腺泡、乳头、微乳头等可辨认的腺癌结构。实性区肿瘤细胞AB/PAS染色阳性。多数病例肿瘤细胞呈多角形,伴有不同程度异型性,核分裂活性较低。部分病例肿瘤细胞呈大细胞、嗜酸细胞、印戒细胞或几种细胞形态混合存在。在SPAC实体性成分的外围常常含有贴壁、腺泡、筛状、乳头、微乳头等可明确辨认的腺癌结构。(2)伴有粘液的完全性实体型腺癌肿瘤呈完全的实体性生长结构。肿瘤细胞AB/PAS染色阳性。多数病例肿瘤细胞呈多角形,伴有不同程度异型性,核分裂像1～6个/10HPF。部分病例肿瘤细胞呈大细胞、嗜酸细胞、印戒细胞或几种细胞形态混合存在,其中3例几乎全部由印戒细胞组成。(3)寡粘液的完全性实体型腺癌 肿瘤表现为完全的实体巢状或片状结构。肿瘤细胞AB/PAS染色阴性。大部分病例肿瘤细胞呈多角形,常伴有不同程度异型性,核染色质呈空泡状,可见明显核仁,核分裂活性较高。部分病例肿瘤细胞主要由透明细胞(5例)、横纹肌样细胞(2例)、基底样细胞(1例)或嗜酸细胞(1例)组成。3.肺实体型腺癌的免疫组化特征肺实体型腺癌中,TTF-1、NapsinA的表达率分别为67.9%和66.0%,均明显低于经典型肺腺癌病例组(P<0.05),而CK7表达在两组之间的差别无统计学意义(P>0.05)。肺实体型腺癌与经典型肺腺癌两组病例Ki 67增殖指数之间的差异有统计学意义(P<0.05)。三种不同组织学亚型肺实体型腺癌中TTF-1、NapsinA、CK7表达的阳性率及Ki67增殖指数之间的差异无统计学意义(P>0.05)。所有106例肺实体型腺癌病例中p40、DSC3、CgA、CD56均为阴性。4.肺实体型腺癌的分子学改变106例肺实体型腺癌中,7.5%(8/106)检测出EGFR突变,主要为E19框内缺失突变(62.5%,5/8)和E21点突变(37.5%,3/8)；30.2% (32/106)检测出KRAS突变,主要为12号密码子突变(90.6%,29/32)；8.5% (9/106)存在ALK基因重排。三种不同组织学亚型肺实体型腺癌中EGFR突变率、KRAS突变率及ALK基因重排阳性率之间的差异无统计学意义(P>0.05)5.肺实体型腺癌中LKB1和BRG1蛋白表达及与临床病理参数的关系LKB1和BRG1在肺实体型腺癌中的表达率明显低于经典型肺腺癌和正常肺组织(P<0.001)。106例肺实体型腺癌中,45例(42.5%)LKB1蛋白表达缺失,33例(31.1%)BRG1蛋白表达缺失。LKB1和BRG1在不同组织学亚型肺实体型腺癌中的表达缺失率无明显差异(P>0.05)。在LKB1和BRG1阴性病例中,20.8%(22/106)同时存在LKB1和BRG1表达缺失,LKB1表达缺失与BRG1表达缺失呈正相关。LKB1在吸烟、有脉管侵犯/淋巴结转移/远处转移、临床分期Ⅲ～Ⅳ、高增殖指数的患者中的表达缺失率明显高于对照组(P<0.05)。BRG1在有脉管侵犯/淋巴结转移/远处转移/复发、临床分期Ⅲ～Ⅳ及高增殖指数的患者中的表达缺失率明显高于对照组(P<0.05)。LKB1和BRG1在TTF-1、NapsinA、CK7阴性组的缺失率明显高于TTF-1、NapsinA、CK7阳性组(P<0.05)。LKB1在KRAS突变型病例组的表达缺失率明显高于KRAS野生型病例组(P<0.05)。BRG1在EGFR野生型病例组的表达缺失率明显高于突变型病例组(P<0.05)。6.肺实体型腺癌的预后分析106例肺实体型腺癌患者中,75例(70.8%)患者获得随访资料,生存时间3～78.8月(平均27.4月)。Kaplan-Meier单因素生存分析显示肿瘤体积大、伴有脉管侵犯、淋巴结转移、远处转移、复发、高临床分期(Ⅲ～Ⅳ期)、TTF-1阴性、NapsinA阴性、LKB1表达缺失、BRG1表达缺失及Ki67增殖指数高的患者预后较差。COX多因素分析显示远处转移、TTF-1阴性、NapsinA阴性、LKB1表达缺失及BRG1表达缺失为影响肺实体型腺癌患者预后的独立危险因素。7.LKB1和BRG1阴性肺实体型腺癌的基因测序及FISH检测结果本研究应用基因测序及FISH方法,探讨LKB1和BRG1缺失的机制,发现：21.4% (9/42)的LKB1阴性肺实体型腺癌存在LKBl基因突变,其中4例为移码突变、5例为同义突变,57.5%(23/40)存在LKB1基因缺失或单倍体改变,59.5%(25/42)至少存在一项LKB1基因异常,16.7%(7/42)同时存在LKB1基因突变和LKB1基因缺失或单倍体改变。在LKB1突变病例中,其中2例同时伴有KRAS突变。73.3%(22/30)的BRG1阴性肺实体型腺癌存在BRG1基因突变,共26个突变位点,其中12例为错义突变、2例为移码突变、12例为同义突变,48.3%(14/29)存在BRG1基因缺失或单倍体改变,93.3%(28/30)至少存在一项BRG1基因异常,26.7%(8/30)同时存在BRG1基因突变和BRG1基因缺失或单倍体改变。22例LKB1和BRG1“双阴性”病例中,68.2%(15/22)至少存在1项LKB1或BRG1基因异常,27.3%(6/22)同时存在LKBl和BRG1基因异常。8.LKB1和BRG1阴性肺实体型腺癌的甲基化检测结果36例LKB1阴性的肺实体型腺癌中均未检测到LKB1启动子甲基化。26例BRG1阴性的肺实体型腺癌中均未检测到BRG1启动子甲基化。结论(1)肺实体型腺癌多见于男性吸烟患者,具有高度侵袭性和转移潜能,常伴较高频率KRAS突变。(2)TTF-1、NapsinA、CK7、p40、DSC3、CgA、CD56 抗体组合有助于肺实体型腺癌的病理诊断和鉴别诊断,其中TTF-1、NapsinA、CK7至少一项阳性且p40、DSC3、 CgA、CD56均为阴性是确诊肺实体型腺癌的必要条件。(3)肺实体型腺癌包括实体为主型腺癌伴粘液产生、伴有黏液的完全性实体型腺癌和寡粘液的完全性实体型腺癌一系列形态学谱系,三种组织学亚型在临床病理特征、免疫表型、分子学改变及预后方面无明显差别。(4)LKB1和BRG1表达缺失可能参与了肺实体型腺癌的发生,并在肺实体型腺癌的恶性增殖与侵袭转移中发挥重要作用。(5)LKB1与BRG1表达缺失呈正相关,提示二者表达缺失可能在肺实体型腺癌的发生与恶性演进中具有协同作用。(6)LKB1和BRG1表达缺失与肺实体型腺癌TTF1、NapsinA.CK7免疫表型相关,LKB1和BRG1在TTF-1/NapsinA/CK7阴性病例组的表达缺失率明显高于阳性组,提示LKB1和BRG1表达缺失可能是TTF-1/NapsinA/CK7阴性肺实体型腺癌发生发展中的重要机制。(7)LKB1表达缺失常与KRAS突变共存,BRG1缺失常与EGFR突变相排斥。(8)肿瘤体积大、伴有脉管侵犯、淋巴结转移、远处转移、高临床分期、TTF-1阴性、NapsinA阴性、LKB1表达缺失、BRG1表达缺失及Ki67增殖指数高的患者预后较差。COX多因素分析显示远处转移、TTF-1阴性、Napsin A阴性、LKB1表达缺失及BRG1表达缺失为影响肺实体型腺癌患者预后的独立危险因素。(9)LKB1在肺实体型腺癌中的失活至少部分是由LKB1基因突变以及LKB1基因缺失或单倍体改变所致；BRG1基因突变以及BRGl基因缺失或单倍体改变是肺实体型腺癌中BRG1表达缺失的主要机制。(10)肺实体型腺癌中LKB1或BRG1表达缺失不是由LKB1和BRG1启动子甲基化导致。