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Grb-AST3是从蟋蟀（Gryllus bimaculatus）脑中分离的一种咽侧体抑制素，体外实验显示它强烈抑制昆虫咽侧体合成保幼激素。这个多肽含有13个氨基酸残基，一级结构为N-GKRAGGRQYGFGL。蟋蟀AST基因共编码15个AST多肽，AST2是第3和第4个，其编码序列定名为Grb-AST3。本论文采用改进的PCR“自身模板-引物”法进行构建方法构建Grb-AST3串联体，并将拼接好的串联体转入大肠杆菌进行表达分析。 根据Grb-AST3和GKR（AST神经肽之间的连接序列）的编码序列设计合成两对引物。第一对中的一个引物，含有一个精氨酸稀有密码子，第二对引物则根据密码子的兼并性，所有碱基都置换成大肠杆菌偏爱的密码子。两对引物分别通过T4DNA Polymerase的拼接和高保真DNA聚合酶（PyrobestTM DNA Polymerase）的扩增来得到Grb-AST3多拷贝串联体。由于PyrobestTM DNA聚合酶扩增得到的PCR产物为平滑末端，因此选用pSK克隆载体上的EeoRV平末端酶切位点进行不定向克隆。从第一对引物的拼接产物中克隆到一个360bp含有9个拷贝数的Grb-AST3的串联体，从第二对引物的拼接产物中克隆到三个分别为515、750、792bp的Grb-AST3的串联体。 根据基因在克隆载体pSK上的插入方向，按照正确的阅读框，将Grb-AST3串联体基因分别克隆在大肠杆菌pET21b、pET22b、pET30a三个不同的表达载体上。测序表明读码框架正确后，将重组子分别转入表达宿主菌E.coli BL21（DE3）PlysS进行表达分析。通过诱导表达，结果，克隆在pET30a表达载体上的串联体基因Grb-A3C1、Grb-A3C3分别都表达出目的蛋白，且表达量约为6.8％和14.7％。而克隆在pET22b载体上的Grb-A38基因则表达量极低，表达量仅为0.8％。初步认为Grb-AST3串联体基因适宜采用融合表达载体表达。