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研究目的：
目前，临床上有很多因素影响男性生殖系统健康，如药物。药物丙泊酚（Propofol，PRO）是一种临床上广泛使用的短效静脉麻醉剂。由于它具有麻醉诱导起效时间短、苏醒快且功能恢复较完善以及手术后病人恶心和呕吐的发生率低等优点，PRO在临床上被普遍用于麻醉的诱导、麻醉的维持和ICU危重病人的镇静等。但是，PRO对男性生殖健康的影响及其机理尚不清楚。睾丸间质细胞（LeydigCell，LC）是维持男性生殖系统功能的重要细胞，它通过合成雄激素来调节男性的生殖系统功能，包括精子的发生和第二性征的维持。幼睾丸间质细胞（immatureLeydigCell，ILC）具有合成和代谢雄激素的能力，产生雄二醇和睾酮，以雄二醇为主。其不仅包含雄激素合成酶如细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶（CYP11A1）、3β-羟基类固醇脱氢酶同工酶1（HSD3B1）、细胞色素P45017α-羟化酶/17-20裂解酶（CYP17A1）和17β-羟基类固醇脱氢酶同工酶3（HSD17B3），也包含雄激素代谢酶如类固醇5α-还原酶同工酶1（SRD5A1）和3α-羟基类固醇脱氢酶（AKR1C14）。雄激素合成从底物胆固醇开始，先由线粒体内膜中的CYP11A1合成孕烯醇酮（P5），P5自由扩散到周边的内质网中，进一步由HSD3B1催化合成孕酮（P4），P4在内质网中的CYP17A1催化下转化成雄烯二酮（D4），D4由HSD17B3催化成睾酮；雄激素在ILC内质网中的SRD5A1催化下形成双氢睾酮（DHT），其在细胞浆中的AKR1C14催化下代谢成雄二醇，分泌到细胞外。本研究以雄性SpragueDawley（SD）大鼠为模型，研究PRO暴露对大鼠ILC合成与代谢雄激素的影响，并探索其作用机制。
研究方法：
取20只35日龄的雄性SD大鼠，处死，取睾丸。根据Percoll梯度离心法，分离和纯化原代ILC。用PRO对ILC进行处理。在基础培养基条件下，加入促黄体生成素作为激素或8溴cAMP（8BR）作为信号化合物，诱导ILC合成雄激素。也添加雄激素合成酶和代谢酶的底物，如22R-羟基胆固醇（22R，CYP11A1的底物）、P5（HSD3B1的底物）、P4（CYP17A1的底物）、D4（HSD17B3的底物）、睾酮（SRD5A1的底物）和DHT（AKR1C14的底物），培养3小时，测量培养基中的雄二醇和睾酮水平，来分析PRO的作用靶点。用RT-qPCR测量ILC的mRNA（Lhcgr、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1、Hsd17b3、Srd5a1和Akr1c14）的变化。蛋白质印迹（Westernblot）测量ILC的蛋白（LHCGR、CYP11A1和CYP17A1）以及相关信号通路的蛋白（ERK1/2和AKT1）及其磷酸化蛋白（pERK1/2和pAKT1）的变化。通过流式细胞学方法测量ILC的活性氧（ROS）水平和细胞凋亡发生率。提取大鼠与人睾丸线粒体、胞质和微粒体蛋白分别进行PRO对CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1、HSD17B3、SRD5A1和AKR1C14酶活性的直接影响，并计算半数最大抑制浓度（IC50）值，通过添加不同浓度的类固醇底物分析PRO对雄激素合成酶和代谢酶的抑制作用方式。
研究结果：
实验数据表明，经过3小时的处理，PRO可以显著降低基础、促黄体生成素刺激或8BR刺激条件下的雄激素水平。进一步的研究表明，尽管PRO在50μM浓度时上调Lhcgr的表达，但它显著下调Cyp11a1和Cyp17a1的表达。在5μM和50μM浓度时PRO降低CYP11A1和CYP17A1的蛋白水平，提示PRO主要通过下调Cyp11a1和Cyp17a1基因的表达而降低两个ILC重要的雄激素合成酶蛋白水平。PRO也抑制ERK1/2蛋白的磷酸化，但不影响总ERK1/2的水平；PRO不影响AKT1蛋白及其磷酸化蛋白的水平。提示PRO主要通过调节EKR1/2的磷酸化发挥作用。PRO在5μM和50μM时诱导ILC产生ROS，在50μM时诱导其细胞凋亡。另外，PRO直接抑制大鼠和人睾丸HSD3B酶活性，IC50分别为1.011±0.065μM和3.498±0.067μM，其对HSD3B的抑制方式是竞争性抑制。在100μM浓度时，PRO并不直接抑制大鼠和人睾丸的CYP11A1、CYP17A1和HSD17B3的酶活性。
结论：本研究表明，PRO可以通过多种机制干扰大鼠ILC的功能：直接抑制大鼠ILC的HSD3B酶活性并下调Cyp11a1和Cyp17a1基因的表达，进而抑制大鼠ILC合成雄激素的能力，提示PRO对大鼠LC的雄激素合成有明显的毒性。
目前，临床上有很多因素影响男性生殖系统健康，如药物。药物丙泊酚（Propofol，PRO）是一种临床上广泛使用的短效静脉麻醉剂。由于它具有麻醉诱导起效时间短、苏醒快且功能恢复较完善以及手术后病人恶心和呕吐的发生率低等优点，PRO在临床上被普遍用于麻醉的诱导、麻醉的维持和ICU危重病人的镇静等。但是，PRO对男性生殖健康的影响及其机理尚不清楚。睾丸间质细胞（LeydigCell，LC）是维持男性生殖系统功能的重要细胞，它通过合成雄激素来调节男性的生殖系统功能，包括精子的发生和第二性征的维持。幼睾丸间质细胞（immatureLeydigCell，ILC）具有合成和代谢雄激素的能力，产生雄二醇和睾酮，以雄二醇为主。其不仅包含雄激素合成酶如细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶（CYP11A1）、3β-羟基类固醇脱氢酶同工酶1（HSD3B1）、细胞色素P45017α-羟化酶/17-20裂解酶（CYP17A1）和17β-羟基类固醇脱氢酶同工酶3（HSD17B3），也包含雄激素代谢酶如类固醇5α-还原酶同工酶1（SRD5A1）和3α-羟基类固醇脱氢酶（AKR1C14）。雄激素合成从底物胆固醇开始，先由线粒体内膜中的CYP11A1合成孕烯醇酮（P5），P5自由扩散到周边的内质网中，进一步由HSD3B1催化合成孕酮（P4），P4在内质网中的CYP17A1催化下转化成雄烯二酮（D4），D4由HSD17B3催化成睾酮；雄激素在ILC内质网中的SRD5A1催化下形成双氢睾酮（DHT），其在细胞浆中的AKR1C14催化下代谢成雄二醇，分泌到细胞外。本研究以雄性SpragueDawley（SD）大鼠为模型，研究PRO暴露对大鼠ILC合成与代谢雄激素的影响，并探索其作用机制。
研究方法：
取20只35日龄的雄性SD大鼠，处死，取睾丸。根据Percoll梯度离心法，分离和纯化原代ILC。用PRO对ILC进行处理。在基础培养基条件下，加入促黄体生成素作为激素或8溴cAMP（8BR）作为信号化合物，诱导ILC合成雄激素。也添加雄激素合成酶和代谢酶的底物，如22R-羟基胆固醇（22R，CYP11A1的底物）、P5（HSD3B1的底物）、P4（CYP17A1的底物）、D4（HSD17B3的底物）、睾酮（SRD5A1的底物）和DHT（AKR1C14的底物），培养3小时，测量培养基中的雄二醇和睾酮水平，来分析PRO的作用靶点。用RT-qPCR测量ILC的mRNA（Lhcgr、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1、Hsd17b3、Srd5a1和Akr1c14）的变化。蛋白质印迹（Westernblot）测量ILC的蛋白（LHCGR、CYP11A1和CYP17A1）以及相关信号通路的蛋白（ERK1/2和AKT1）及其磷酸化蛋白（pERK1/2和pAKT1）的变化。通过流式细胞学方法测量ILC的活性氧（ROS）水平和细胞凋亡发生率。提取大鼠与人睾丸线粒体、胞质和微粒体蛋白分别进行PRO对CYP11A1、HSD3B1、CYP17A1、HSD17B3、SRD5A1和AKR1C14酶活性的直接影响，并计算半数最大抑制浓度（IC50）值，通过添加不同浓度的类固醇底物分析PRO对雄激素合成酶和代谢酶的抑制作用方式。
研究结果：
实验数据表明，经过3小时的处理，PRO可以显著降低基础、促黄体生成素刺激或8BR刺激条件下的雄激素水平。进一步的研究表明，尽管PRO在50μM浓度时上调Lhcgr的表达，但它显著下调Cyp11a1和Cyp17a1的表达。在5μM和50μM浓度时PRO降低CYP11A1和CYP17A1的蛋白水平，提示PRO主要通过下调Cyp11a1和Cyp17a1基因的表达而降低两个ILC重要的雄激素合成酶蛋白水平。PRO也抑制ERK1/2蛋白的磷酸化，但不影响总ERK1/2的水平；PRO不影响AKT1蛋白及其磷酸化蛋白的水平。提示PRO主要通过调节EKR1/2的磷酸化发挥作用。PRO在5μM和50μM时诱导ILC产生ROS，在50μM时诱导其细胞凋亡。另外，PRO直接抑制大鼠和人睾丸HSD3B酶活性，IC50分别为1.011±0.065μM和3.498±0.067μM，其对HSD3B的抑制方式是竞争性抑制。在100μM浓度时，PRO并不直接抑制大鼠和人睾丸的CYP11A1、CYP17A1和HSD17B3的酶活性。
结论：本研究表明，PRO可以通过多种机制干扰大鼠ILC的功能：直接抑制大鼠ILC的HSD3B酶活性并下调Cyp11a1和Cyp17a1基因的表达，进而抑制大鼠ILC合成雄激素的能力，提示PRO对大鼠LC的雄激素合成有明显的毒性。